名古屋大学转化生物分子研究所(ITbM)的一对植物生物学家在植物和细胞生理学杂志上报道了开发新载体(转移遗传信息的载体)以敲除靶基因在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，以高效和可遗传的方式。基因组由生物体的完整DNA组成，包括其基因，其中包含开发和维持生物体所需的所有信息。基因组工程涉及通过去除，添加和改变DNA序列的部分对基因组部分进行特异性修饰，是一种快速发展的技术。到目前为止，CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/ Cas9(CRISPR相关蛋白9)系统是其最简单，通用性和效率最常用的遗传操作方法之一。

尽管如此，迄今为止，诱导CRISPR / Cas9对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的效率的突变仍然有些低。这是因为基因突变的触发因素在细胞的后期发育阶段被激活。因此，需要大量的时间，努力和植物物种来获得具有敲除的靶基因的所需植物物种。

CRISPR / Cas9由2个关键分子组成，一片称为引导RNA(gRNA)的RNA和一种名为Cas9的酶。Cas9充当分子剪刀，可以切割基因组中特定位置的DNA上的两条链，从而可以在该位置添加或去除DNA序列。另一方面，gRNA由预先设计的RNA序列(约20个碱基长)组成，其位于较长的RNA支架内。RNA支架与DNA结合，预先设计的RNA序列将Cas9蛋白引导至基因组的特定部分，因此Cas9可以在目标位置切割。

“通过使用从植物细胞早期胚胎期表达的RIBOSOMAL PROTEIN S5A(RPS5A)基因的启动子，我们能够诱导Cas9蛋白高效敲除卵细胞中的基因，”Hiroki Tsutsui说，这项研究的第一作者。“这种RPS5A启动子在卵细胞中具有活性，我们决定将这种分子工具称为pKAMA-ITACHI Red(pKIR)载体，它可以相对于植物中常用的35S启动子高效编辑植物的基因组，”他继续说道。 。

'Kama-itachi'具有三种类似黄鼠狼的生物的日本含义，其中第一只黄鼠狼瞄准并绊倒一个人，其次是第二只黄蜂通过切割它来伤害这个人，第三只用来治愈这个人。这类似于CRISPR / Cas9系统对DNA的过程，其中CRISPR靶标，Cas9切割，并诱导感兴趣的特定DNA序列的修复。

“通过能够有效地敲除拟南芥中的靶基因，我们认为这是阐明植物遗传功能的有前景的方法，”该研究的教授和领导者Tetsuya Higashiyama说。“我们希望我们可以将这种方法应用于甘蓝型油菜等作物的基因组编辑，以加速其生长并产生多种植物系。”

CRISPR / Cas9系统通过敲除特定基因来研究它们的功能。在模型植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，由于Cas9蛋白在细胞的后期发育阶段表达，基因敲除的程度根据组织而变化。因此基因组突变效率相对较低。

例如，当使用常用的植物35S启动子在拟南芥中表达Cas9蛋白时，尽管在叶中观察到基因的频繁敲除，但在花中仅检测到少数。这表明靶基因的敲除突变效率在花的生殖细胞中相对较低。随后，敲除突变难以传递给下一代的子细胞。

“通过能够有效地敲除拟南芥中的靶基因，我们认为这是阐明植物遗传功能的有前景的方法，”该研究的教授和领导者Tetsuya Higashiyama说。“我们希望我们可以将这种方法应用于甘蓝型油菜等作物的基因组编辑，以加速其生长并产生多种植物系。”

CRISPR / Cas9系统通过敲除特定基因来研究它们的功能。在模型植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，由于Cas9蛋白在细胞的后期发育阶段表达，基因敲除的程度根据组织而变化。因此基因组突变效率相对较低。

例如，当使用常用的植物35S启动子在拟南芥中表达Cas9蛋白时，尽管在叶中观察到基因的频繁敲除，但在花中仅检测到少数。这表明靶基因的敲除突变效率在花的生殖细胞中相对较低。随后，敲除突变难以传递给下一代的子细胞。

为了解决这个问题，Higashiyama的小组决定在早期发育阶段在卵细胞和细胞中表达Cas9蛋白，以提高基因的敲除效率。

“由于卵细胞和受精卵细胞(受精卵)是植物细胞发育和生长的起源，我们认为如果在早期阶段进行基因组编辑，基因突变可能会高效率地发生，并且可以被下一代遗传。细胞的生成，“Tsutsui解释说。“pKIR载体是理想的，因为它可以在卵细胞期和发育阶段连续表达Cas9蛋白。”

该团队首先尝试敲除PDS3(Phytoene DeSaturase 3)基因，该基因已知是植物中叶绿素合成的原因。没有叶绿素，植物将成为具有白色外观的白化物种。通过用pKIR表达Cas9，Tsutsui成功观察到PDS3基因的敲除，表现为白化植物的产生。

Tsutsui还研究了当PDS3基因被敲除时对花茎中合成的叶绿素量的影响。在使用35S启动子表达Cas9时，叶绿素的量仅与野生型中观察到的量略有不同。另一方面，当通过pKIR诱导Cas9时，叶绿素的量急剧下降，表明基因的敲除已经有效地发生。

该小组还发现，pKIR载体成功击倒在拟南芥中的其他基因，如AGAMOUS(AG)，DUO1(DUO花粉1)，和ADH1(醇脱氢酶1)，其参与了花，精子的发展细胞和分别将醇转化为醛的酶。

AGAMOUS是参与花发育(花分生组织)的转录因子。在敲除由pKIR诱导的AGAMOUS基因后，观察到花中的花，称为双花，其频率高。另外，在由pKIR诱导的编码雄性生殖系的DUO1基因的敲除实验中，生殖细胞的细胞分裂受损并且观察到不能生育的精子样细胞。

编码将烯丙醇转化为丙烯醛(醛)的酶的ADH1基因也被高频率的pKIR诱导敲除。这种高频率表明ADH1基因在第一代的所有生殖细胞(卵细胞和精子细胞)中被敲除。具有ADH1基因敲除的突变体能够存活，而野生型和杂合植物由于丙烯醛的产生而被杀死，丙烯醛对植物有毒。

“由于第二代中的所有物种都表现出相同的突变模式，这表明基因组编辑发生在发育阶段的早期(第一代卵细胞中)，”Tsutsui说。

为了容易地鉴定安装有CRISPR / Cas9基因的物种，含有Cas9的种子用红色荧光标记。

Tsutsui和Higashiyama已经找到了一种有效的拟南芥基因组编辑方法，该方法包括用一种RPS5A启动子(pKIR载体)表达Cas9，该启动子可以在早期发育阶段敲除细胞中的基因并诱导可以传递给细胞的突变。下一代的女儿细胞。

“这种pKIR方法可以让我们研究可能具有重叠功能的基因簇，”Tsutsui说。“以前，我们必须通过交叉现有的突变体来检测重叠的基因功能来制造多个敲除植物，这需要时间。我们应该能够通过我们相对低成本的方法快速获取突变体来探索未鉴定的基因簇的功能。 “

“我们希望我们能够继续改进这种方法，以提高突变效率，使其成为一种有用的基因组工程工具，用于修饰各种生物中的靶DNA序列，”Higashiyama说。