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CRISPR研究人员开发精确 无模板基因组编辑的方法

通过创建机器学习算法,预测人类和小鼠细胞如何响应CRISPR诱导的DNA断裂,由Broad研究所和布莱根妇女医院的研究人员领导的研究小组发现,细胞通常以精确的方式修复破碎的基因。可预测的,有时甚至将突变的基因恢复到健康的版本。此外,研究人员将这种预测能力用于测试并成功纠正了患有两种罕见遗传疾病之一的患者细胞的突变。

CRISPR研究人员开发精确 无模板基因组编辑的方法

非同源末端连接(NHEJ)和微同源介导的末端连接(MMEJ)过程是涉及修复Cas9介导的双链断裂的主要途径,其可导致包含数百种修复基因型的高度异质性修复结果。虽然已经利用Cas9介导的双链DNA断裂的末端连接修复来促进DNA模板的敲入或两个切割位点之间的间插序列的缺失,但NHEJ和MMEJ通常被认为不适用于精确基因组编辑应用,研究人员指出

他们开发了高通量化脓性链球菌Cas9(SpCas9)介导的修复结果分析,以基于人类基因组的序列特征使用1,872个靶位点表征Cas9诱导的双链断裂的末端连接修复产物。

然后,他们使用得到的指导RNA库来训练他们在德尔菲命名的机器学习模型,以预测5种人和小鼠细胞系中高至1至60碱基对缺失和1碱基对插入的基因型和频率。 。InDelphi预测,5%至11%的针对人类基因组的Cas9指导RNA将成为研究人员所称的“精确50” - 产生的单一基因型占所有主要编辑产品的50%以上。

通过各种实验,他们证实195个人类疾病相关等位基因的精确-50插入和缺失,包括将致病等位基因的原发性患者衍生成纤维细胞修正为Hermansky-Pudlak综合征的野生型基因型,导致血液凝固缺乏和白化病,和门克斯病,导致铜缺乏。

他们使用德尔福设计14种gRNA进行高精度无模板编辑,在内源性人类疾病相关基因座中产生可预测的1-bp插入基因型,并在两种人类细胞系中进行实验证实高度精确的编辑。“我们使用德尔菲揭示人类致病等位基因,这些等位基因是有效和精确的无模板功能获得基因型校正的候选者,并且在野生型基因型中获得了183个致病性人类微复制等位基因的无模板校正,≥50%编辑产品,“作者写道。“最后,我们整合这些发展,以实现人和小鼠细胞中五种致病性低密度脂蛋白受体(LDLR)微复制等位基因的高精度校正,

重要的是,研究人员得出结论,预测Cas9介导的产品的能力可以实现新的精确基因组编辑研究应用并促进现有应用,例如执行有效的双等位基因敲除和预测HDR的末端连接副产物。

此外,他们发现抑制NHEJ增强了病原微复制等位基因的修复,这表明临时操作DNA修复途径可以与Cas9介导的编辑相结合,以高精度地支持特定的编辑基因型。研究人员还认为,如果在德尔菲获得适当的训练数据,它还可以学习准确预测其他设计师核酸酶的修复基因型。

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