YCJ制

XXXXXXXX

项目名称EZ-PCR检测支原体验证方案

项目编号

起草人

审核人

批准人

日期

日期

日期

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YCJ制

目录

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

概述....................................................................................................................................3

适用范围............................................................................................................................3

验证目的............................................................................................................................3

验证项目............................................................................................................................3

参考文件............................................................................................................................3

验证小组成员及职责........................................................................................................4

验证过程............................................................................................................................4

实验材料....................................................................................................................4

实验仪器及设备........................................................................................................4

专属性验证................................................................................................................4

检测限验证................................................................................................................6

重现性验证................................................................................................................8

耐用性验证................................................................................................................9

7.1.

7.2.

7.3.

7.4.

7.5.

7.6.

8.

9.

验证结果分析..................................................................................................................11

验证评价..........................................................................................................................11

10.验证结论..........................................................................................................................11

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1.概述

支原体(Mycoplasma)属于柔膜体纲，是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的

原核细胞微生物，是目前所知能在无生命培养基中生长繁殖的最小的微生物。与梭菌

属、酸杆菌属及链球菌属在进化上相近。支原体是细胞污染物中比较常见的一种，

细胞受支原体污染程度较轻时，不会表现出明显的症状，但一旦这种潜伏的污染爆发

时，细胞会大量脱落，细胞培养液会变浑浊。原代细胞和传代细胞都可能遭受支原体

污染，根据国外不同实验室的调查结果显示，有15%-80%的细胞被支原体污染，传

代细胞的污染率高于原代细胞。尽管自然界中存在的支原体有120多种，但污染细

胞的支原体主要有5种，分别为牛源的莱氏无胆甾原体和精氨酸支原体，人源的口

腔支原体和发酵支原体，猪源的猪鼻支原体，这5种支原体占所有支原体污染的95%

以上。支原体污染可能来自操作人员和细胞培养用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能

来自于本身已被污染的细胞系和毒种。细胞受支原体污染后，功能和活性都会受到影

响，会带来不可靠的实验结果和不安全的细胞制品，因此对细胞进行支原体检测实属

必要。

我国药典第三部明确规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临

床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染

法）。直接培养法具有较高的灵敏度，但整个实验所需周期长，指示细胞法相对实验

周期短。生物化学法干扰因素较多，ELISA法检测范围有限，因此这两个方法都不

能得到普及。在这些方法出现的同时，PCR法得到了发展，PCR因其高敏感性、明

确及快捷的特点简化了细胞培养中支原体污染检测过程。BI的EZ-PCR方法检测支

原体，检测用的样品仅经过离心分离及悬浮在缓冲液中即可开始PCR反应。琼脂糖

凝胶电泳后，阳性模板得到一个270bp的片段，整个过程只需3-4小时。

2.适用范围

本验证方法适用于BI公司的EZ-PCR支原体污染检测试剂盒检测细胞终制品中支

原体污染方法的验证

3.验证目的

建立细胞终制品的EZ-PCR支原体检测，并对其有效性进行评价，确保试验方法

的稳定性，保证试测结果真实可靠。

4.验证项目

对该方法的专属性、检测限、重现性及耐用性逐一进行验证。

5.参考文件

《中国药典》2015版3301支原体检查法

《中国药典》2015版9201药品微生物检验替代方法验证指导原则

《终制品支原体检测标准操作规程》

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6.验证小组成员及职责

姓名职责

7.验证过程

7.1.实验材料

7.1.1.菌种：肺炎支原体（ATCC15531株）、口腔支原体（ATCC23714株）、丁酸梭菌、

酸杆菌、肺炎链球菌。

7.1.2.细胞：无支原体污染的Vero细胞。

7.1.3.培养基：支原体液体培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、支原体半流体培养基、DMEM

完全培养基、DMEM无抗生素培养基。

7.1.4.试剂：二苯甲酰胺荧光染料工作液、固定液、封片液、SYBR荧光染料等。

7.1.5.试剂盒：EZ-PCR支原体污染检测试剂盒、DNA提取试剂盒等。

7.1.6.其他：无菌水、Marker、琼脂糖等。

7.2.实验仪器及设备

PCR仪、电泳仪、离心机、二氧化碳孵箱、超净工作台、荧光显微镜等。

7.3.专属性验证

7.3.1.定义：专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力，其专属性验证应

确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果。

7.3.2.说明：本实验专属性验证采用无支原体污染的Vero细胞代替样品细胞来确认样品细

胞DNA的存在是否对检验结果造成影响；用与支原体进化相似的丁酸梭菌、酸杆

菌、肺炎链球菌代替支原体进行检验，来验证相似微生物的DNA是否对检验结果造

成影响。

细胞验证：用DNA提取试剂盒提取Vero细胞DNA，过程中注意防止支原体污

染，依据EZ-PCR支原体污染检测试剂盒使用说明对提取的DNA进行EZ-PCR扩增，

电泳，最后进行凝胶成像，观察结果，在270bp左右是否出现特异性条带。以加入

支原体菌株的Vero细胞样品作为样品阳性对照；以上实验做5组平行。结果记录如

下表：（原始电泳图见附件一）

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项目

阴性对照

编号

1

1

无支原体

Vero细胞

2

3

4

5

实验人/日期

结果

支原体阳性

Vero细胞

项目

阳性对照

编号

1

1

2

3

4

5

审核人/日期

结果

注：在“结果”中，270bp左右无条带记录为“—”，有条带记录为“+”。

结果说明：当阴性对照为“—”，阳性对照为“+”，实验结果方有效。若“无支原体

Vero细胞”结果均为“—”，“支原体阳性Vero细胞”结果均为“+”，则说明样品细

胞DNA的存在不会对检验结果造成影响，若结果有异，则需重新验证。

7.3.4.相似菌株验证：用试剂盒分别提取丁酸梭菌、酸杆菌、肺炎链球菌DNA，方法同

Vero细胞验证，每个样品做5组平行，结果记录如下：（原始电泳图见附件二）

项目

阴性对照

编号

1

1

2

丁酸梭菌3

4

5

1

2

肺炎链球菌3

4

5

实验人/日期

结果

口腔支原体

酸杆菌

项目

阳性对照

编号

1

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

审核人/日期

结果

注：在“结果”中，270bp左右无条带记录为“—”，有条带记录为“+”。

结果说明：当阴性对照为“—”，阳性对照为“+”，实验结果方有效。若“丁酸梭菌”

“酸杆菌”“肺炎链球菌”结果均为“—”，“口腔支原体”结果均为“+”，则说明

与支原体类似菌株不会对检验结果造成影响，若结果有异，则需重新验证。

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7.4.检测限验证

7.4.1.定义：检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低

数量。

7.4.2.说明：检测限确定的方法是在有样品中接种较低浓度的支原体（每单位不超过5CFU），

然后分别采用药典直接培养法、指示细胞培养法和EZ-PCR法对支原体进行检验，以

检出与否来比较药典种方法与EZ-PCR方法的差异，最后采用卡方检验（χ2）来评价

这些方法的检测限是否存在差异。

7.4.3.方法：将肺炎支原体和口腔支原体分别接种于适宜的培养基中，经36℃±1℃培养至

培养基变，盲传两代后，将培养物进行10倍稀释，肺炎支原体取10-7、10-8、10-9、

10-10梯度菌液，口腔支原体取10-3、10-4、10-5、10-6梯度菌液。制成待测供试品。两

种菌株每个梯度各取1ml菌液分别进行直接培养、指示细胞培养和EZ-PCR,每个培

养做三组平行，结果记录如下：（原始记录见附件三）

菌株

肺炎

支原

体

梯度

10-7

10-8

10-9

10-10

10-3

10-4

10-5

10-6

直接培养法指示细胞法

审核人/日期

EZ-PCR

口腔

支原

体

实验人/日期

注：对于直接培养法和指示细胞法，“+”表示检查结果为阳性，“—”表示检查结果

为阴性；对于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特异性条带，“—”表示在270bp

左右无特异性条带。

对结果进行卡方检验分析。

7.4.4.直接培养法操作步骤

7.4.4.1.支原体培养基灵敏度检查

7.4.4.1.1.操作：将肺炎支原体、口腔支原体接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃

培养至培养基变，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列

稀释，肺炎支原体稀释至10-7~10-9，接种在支原体肉汤培养基中；口腔支原体稀

释至10-3~10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，

置于36℃±1℃培养7~14天，观察培养基变结果。（记录见附件三）

7.4.4.1.2.结果判定：以接种后培养基管数的2/3以上呈现变的最高稀释度为该培养基的

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灵敏度（肺炎支原体应达到10-8），口腔支原体应达到10-4。

7.4.4.2.检查法

7.4.4.2.1.操作：供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2~8℃；超过

24小时应置于-20℃贮存。

半流体培养基在使用前应煮沸10~15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能小牛

血清（培养基：血清为8:2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基

除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。

取每只装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2

支，每只培养基接种供试品1，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4

支支原体液体培养基中各取2支进行次代培养，每支培养基分别转种至相应的支

原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3

天观察1次。（记录见附件三）

7.4.4.2.2.结果判定：培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为

合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判

断为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。

7.4.5.指示细胞培养法步骤

7.4.5.1.预处理

7.4.5.1.1.指示细胞：取培养的Vero细胞经消化后，制成每1ml含105的细胞悬液，以每孔

0.5ml接种6孔细胞培养板，每孔再加无抗生素培养基3ml，于5%二氧化碳孵箱

中36℃±1℃培养过夜，备用。

7.4.5.1.2.测定法：于制备好的指示细胞培养板中加入支原体菌悬液1ml，置5%二氧化碳

孵箱36℃±1℃培养3~5天。指示细胞培养物至少传代一次，末次传代培养用含

盖玻片的6孔培养3~5天后，吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5

分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟，吸出固定液，使盖玻片在空

气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，吸出染

液，每孔用水5ml洗3次，吸出水，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片

液1滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。用无

抗生素培养基1ml代替支原体菌悬液，同法操作，作为阴性对照。

取稀释梯度为10-2的肺炎支原体和口腔支原体混合液1ml代替支原体菌悬液作为

阳性对照。（结果记录于附件三）。

7.4.5.2.结果判定

7.4.5.2.1.阴性对照：仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿荧光。

7.4.5.2.2.阳性对照：荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着颗粒。

当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。

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如果供试品为阴性，则供试品判为合格；如供试品结果为阳性或可疑时，应进行

重试；如仍为阳性时，供试品判为不合格。

7.5.重现性验证

7.5.1.定义：重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点、实验人员、仪器、

试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。

7.5.2.说明：在待测样品中接种稀释梯度为10-2的口腔支原体和肺炎支原体混合菌悬液1ml，

采用直接培养法、指示细胞法和EZ-PCR，分别由三个同事在不同的时间使用不同的

PCR仪进行检验，最后采用卡方检验（χ2）来评价这些种方法的检测限是否存在差

异。

7.5.3.方法：

7.5.3.1.供试液制备：取细胞制备过程中细胞上清液作为检测样品，每次检验量为1ml，另

加入稀释梯度为10-2的口腔支原体和肺炎支原体混合菌悬液1ml，因此总体积为

2ml，细胞上清取样后置于-20℃保存。

7.5.3.2.直接培养法、指示细胞法和EZ-PCR方法如前所述。

7.5.3.3.第一次试验：分别由同事A、同事B、同事C在相同实验条件下使用PCR仪○1进

行实验，每次做10个平行，结果记录如下表：（原始记录见附件四）

第一次试验(PCR仪○1)

名称

同事A

直接培养法指示细胞法EZ-PCR

同事B

同事C

实验人/日期审核人/日期

注：对于直接培养法和指示细胞法，“+”表示检查结果为阳性，“—”表示检查结果

为阴性；对于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特异性条带，“—”表示在270bp

左右无特异性条带。

7.5.3.4.第二次试验：一周后，分别由同事A、同事B、同事C在相同实验条件下使用PCR

仪○2进行实验，每次做10个平行，结果记录如下表：（原始记录见附件五）

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第二次试验（PCR仪○2）

名称

同事A

直接培养法指示细胞法EZ-PCR

同事B

同事C

实验人/日期审核人/日期

注：对于直接培养法和指示细胞法，“+”表示检查结果为阳性，“—”表示检查结果

为阴性；对于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特异性条带，“—”表示在270bp

左右无特异性条带。

7.5.3.5.第三次试验：两周后，分别由同事A、同事B、同事C在相同实验条件下使用PCR

仪○3进行实验，每次做10个平行，结果记录如下表：（原始记录见附件六）

第三次试验（PCR仪○3）

名称

同事A

直接培养法指示细胞法EZ-PCR

同事B

同事C

实验人/日期审核人/日期

注：对于直接培养法和指示细胞法，“+”表示检查结果为阳性，“—”表示检查结果

为阴性；对于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特异性条带，“—”表示在270bp

左右无特异性条带。

7.5.4.结果分析：对上述结果进行卡方检验，评价方法间的差异。

对每次PCR的结果进行统计分析，对重现性进行评价。

7.6.耐用性验证

7.6.1.定义：耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方

法正常使用时的可靠性提供依据。

7.6.2.说明：本次耐用性对样品存储温度、存储时间、样品加样量进行验证。

7.6.3.方法：

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7.6.3.1.存储温度耐用性验证：取细胞培养上清液，加入适量支原体菌悬液，配制成已知支

原体阳性细胞培养上清液。第一组于4℃保存0天（即取即检）、2天、7天、15

天后分别取样进行EZ-PCR检验；第二组于-20℃保存0天（即取即检）、2天、7

天、15天后分别取样进行EZ-PCR检验；每次检验做5组平行，结果记录如下表：

（原始电泳图见附件七）

组号平行

阴性对照

阳性对照

1

第一组2

3

4

5

阴性对照

阳性对照

1

第二组2

3

4

5

实验人/日期

0天2天后

审核人/日期

7天后15天后

注：阴性对照结果为“—”（即不特异性条带），阳性对照结果为“+”（即有特异

性条带）时，试验结果方有效。

7.6.3.2.加样量耐用性验证：取已知支原体阳性细胞培养上清液进行EZ-PCR，其中样品量

分别加1ul、3ul、5ul、6ul，其余用无菌水补齐，每组做5个平行，结果记录如下

表：（原始电泳图见附件八）

平行

阴性对照

阳性对照

1

2

3

4

5

1ul3ul5ul6ul

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试验人/日期审核人/日期

注：阴性对照结果为“—”（即不特异性条带），阳性对照结果为“+”（即有特异

性条带）时，试验结果方有效。

7.6.4.耐用性验证结果分析：经过对存储温度，存储时间及加样量的耐用性验证，可初步

判断EZ-PCR检测支原体污染的耐用性程度，同时也可初步确定样品存储温度、存

储时间及加样量的误差允许范围，为后续实验提供参考。

8.验证结果分析

9.验证评价

10.验证结论

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