220实验动物与

比较更-学LaboratoryAnimalandComparative

Medicine

Jun.2019,39

(3)

doi:10.3969/.l674-5817.2019.03.008

小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞

杀伤活性检测方法的建立

陈丽玲，钟友宝，刘漩，陈来,袁可望，黄丽婷，李姗姗

(江西中医药大学，南昌330004)

［摘要］

目的在建立既能保留人肿瘤生物学特性的，且免疫功能相对正常的人肿瘤异种移植动

物模型的过程中，为保证小鼠脾淋巴细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的考察效率，摸索建立基于流式

细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法。方法用竣基荧光素二乙酸盐

琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人HepG2细胞，利用无水乙醇模拟杀伤人HepG2细胞，用碘化丙唳(PI)

染，流式细胞仪检测，确定CFSE和PI的浓度及作用时间。以小鼠脾细胞为效应细胞，人HepG2

细胞为靶细胞，从效靶作用时间和效靶比方面进行优化，确定试验方法的最佳条件。结果采用

CFSE/PI双标记将细胞分为CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+和CFSE-PI-4个组，可有效区分活

细胞和被杀伤细胞。CFSE标记靶细胞的浓度采用2.5pmol/mL，效靶作用时间为12h,效靶比

10：1。结论建立了基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法，

该方法的建立可为评价动物脾淋巴细胞对异种细胞的杀伤作用提供参考。

［关键词］小鼠；脾淋巴细胞；人HepG2细胞；竣基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE);

碘化丙呢

(PI)；细胞毒活性

［中图分类号］R392.33Q95-33［文献标志码］A

［文章编号］1674-5817(2019)03-0220-06

从动物模梨与临床实际肿瘤的相近性而言，现

有肿瘤动物模烈中，人肿瘤的异种移植模烈是最貝有

的)相遇与其对应的淋巴细胞克隆即被破坏或抑制,

出生后只对胚胎期曾接触过的抗原形成耐受,而对胚

胎时期从未接触过的抗原仍有免疫应答⑶”,在具有应用价值和前景的。而现有成熟的以免疫缺陷动物

作为载体的人源肿瘤模型存在短板:无胸腺裸小鼠的

T

细胞生成障碍导致其无法用于移植肿瘤与特异性

完善免疫系统的KM小鼠基础上，建立适用于人来源

的、且免疫功能相対正常的人肿瘤异种移植动物模

烈，以达到为肿瘤研究,尤其是肿瘤免疫研究提供新

免疫系统相互作用的研究

［1，2］。因此，建立既能保留

人源肿瘤生物学特性，又貝有正常免疫功能的动物模

烈是肿瘤研究,尤其是肿瘤免疫研究急需解决的问题。

的临床前研究模烈的目的。在模梨建立初期，我们

拟向孕鼠子宫内的胎鼠注射人肝癌HepG2细胞，之

后在成功出生且存活的胎鼠肝脏原位移植人肝癌

HepG2细胞,评价成瘤效果，并考察荷瘤小鼠的免疫

功能和对HepG2细胞及其他人肿瘤瘤株的排斥情

我们拟利用“获得性免疫耐受”的机制，

即“在胚

胎时期，体内已有的针対多种抗原具有免疫活性的淋

巴细胞克隆,若与某种抗原(包括自身的或人工导入

［收稿日期］2018-12-24

［基金项目

］

江西省青年科学基金(20161BAB215214);江西省

况。在考察小鼠脾淋巴细胞对人肝癌HepG2

细胞

杀伤作用的过程中，计划检测样本量较大，因此需要

建立一种操作方便、快速的检测方法。目前经常

教育厅科学技术研究项目基金(GJJ14623)

［作者简介］陈丽玲(1983-),女,硕上，主要从事动物营养及免

疫研究。E-mail:465993116@

使用的细胞杀伤活性检测方法中，经典的51Cr释放法

存在自然释放率较高、放射性会対细胞及操作人员

［通信作者］李姗姗(1982-),女，博士,主要从事肿瘤药理、安

全理和毒理研究。Bmail:7M596948@

造成伤害等不足;酸脱氢酶(LDH)释放法因影响因

素较多和背景信号的干扰等问题，应用有限［4］；酶联

Jun.2019,39(3)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine221

免疫斑点（Enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）检

测技术、主要组织相容性复合体（Majorhistocom­

patibilitycomplex,MHC）四聚体显示T细胞受体的染

技术和胞内细胞因子染等技术，只能通过间接检

测T细胞表面受体或细胞因子的水平反应细胞毒性

T淋巴细胞（CytotoxicTlymphocytes,CTL）活性［5］。

竣基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯

（Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,

CFSE）是一种本身不发荧光的活体染料，它可穿透

细胞膜，被胞内酯酶转化成具有绿荧光的氨基反

应性竣基荧光素琥珀酰亚胺酯，同时失去自山透过

细胞的能力，可稳定标示活细胞［

6-8］。碘化丙喘

（Propidiumiodide,PI）是一种可对DNA染的细胞

核染试剂

，其不能通过活细胞膜，但却能穿过破

损的细胞膜，嵌入双链DNA后释放红荧光。

在

效应细胞与靶细胞混合前，先将靶细胞用CFSE

染

，染后的靶细胞与效应细胞混合作用后，再用

PI染，采用流式细胞术即可区分被杀伤靶细胞

及存活靶细胞，并体现效应细胞的死亡情况，测

定效应细胞対靶细胞的杀伤活性，且检测速度较快。

本实验拟建立基于流式细胞术的评价小鼠脾淋

巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法，以准确

检测模烈小鼠脾细胞对人肿瘤细胞的杀伤作用。

1材料与方法

1.1实验动物

SPF级KM小鼠，4周龄，体质量18~22g,

购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司［SCXK（湘）

2013-0004］。饲养于江西中医药大学实验动物科技

中心［SYXK（赣）2017-0004］。实验获得江西中医药

大学实验动物伦理委员会的批准（伦理审杳证号：

JZLLSC207-0021）,并按实验动物使用的3R原则

给予人道主义关怀。

1.2细胞株

人肝癌

HepG2细胞山江西中医药大学中药资源与

民族药研究中心惠赠（购自中国科学院上海细胞库）。

1.3药品及主要试剂

CFSE（批号为S8269）购自美国Selleck生物科技

有限公司；PI（批号为2018/12）购自合肥新恩源生物

技术有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffer

saline,PBS）（批号为20171108）、DMEM高糖培养

基（含双抗，

青霉素100U/mL,

链霉素100|lg/mL）

（批号为20170812）和胎牛血清（批号为RY3201）均购

自天津市澈洋生物制品科技有限责任公司;红细胞裂

解液（批号为20170731）、胰蛋白酶（批号为T1300）

和台盼蓝染液（批号为:20161122）均购自北京索莱宝

科技有限公司。

1.4主要仪器

CO2培养箱（型号为C150）购自德国宾德有限责

任公司，流式细胞仪（型号为FACSVerse）购自美国

BD医疗器械有限公司。

1.5实验方法

1.5.1靶细胞人肝癌HepG2细胞的培养人肝癌

HepG2细胞置于含体积分数10%胎牛血清、100U/mL

青霉素和100pg/mL链霉素的DMEM髙糖培养基

中，移入CO2培养箱，于37

°C

、体积分数5%CO2

及饱和湿度条件下培养。

1.5.2效应细胞小鼠脾淋巴细胞的制备摘眼球取

血后，将小鼠浸泡在体积分数75%乙醇中3min,

移至超净台中无菌取脾脏，开左侧腹部皮肤，分

离皮下组织和肌肉，暴露并小心分离脾脏，放入预

冷PBS中。将脾脏置于200目不锈钢网上，用注

射器内芯头研磨成单细胞，收集后1000r/min离

心5min,弃上清，加入3倍量红细胞裂解液,4°C静

置15min,其间轻轻涡旋混匀2次，1000r/min离心

10min,弃上清，预冷PBS冲洗，含10%胎牛血清的

DMEM高糖培养基调整细胞悬液至不同浓度备用阴。

1.5.3靶细胞人肝癌HepG2细胞的标记

1.5.3.1CFSE及PI对靶细胞的区分效果6孔板接

种HepG2细胞，贴壁，至汇合度约为80%,用

5pmol/mL的CFSE标记10min,PBS洗

1次，加入

含10%胎牛血清的DMEM髙糖培养基及无水乙醇，

使无水乙醇的终浓度分别为0.4mol/L、0.8mol/L、

1.6mol/L［9］,培养6h后，收集细胞,PBS冲洗，加入

PI至终浓度为12.5pg/mL,上流式细胞仪检测。

1.5.3.2CFSE标记对人肝癌HepG2细胞的毒性24

孔板接种HepG2细胞，贴壁，至汇合度约为80%,

分别以2.5pmol/mL、5.0pmol/mL、10pmol/mL

的CFSE标记10min,每隔1h收集细胞，PBS冲

洗，加入PI至终浓度为12.5pg/mL,上流式细胞

仪检测细胞存活率，至第18h结束。未经CFSE

标记的细胞作为对照。

1.5.3.3CFSE标记人肝癌HepG2细胞荧光强度的

222实验动物与

比较更-学LaboratoryAnimalandComparative

Medicine

Jun.2019，39(3)

时间动力学分析24孔板接种HepG2细胞,贴壁

，至

汇合度约为80%,分别以2.5ymol/mL、5.0pmol/mL、

10pmol/mL

的CFSE标记10min,每隔1h收集细

PBS

(Median

24孔板

分析，组间比较采用单因素方养分析（One-Way

ANOVA）讲

采用X2t

差界有统计学意义。

P<0.05为

fluorescentintensity,MFI),至18h结束。

1.5.4CFSE及PI2结果

2.1CFSE标记对人肝癌HepG2细胞的作用

2.1.1CFSE及PIX

接种HepG2

的CFSE标记10min,PBS洗1

4

80%:

1mL浓

时HepG2细胞数约为4X105/孔。以2.5pmol/mL

106/mL的

PBS冲

12.5|lg/mL,一

,CFSE/PI>

10：1作用6h组：CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-

,

CFSE+PI-为未被乙醇杀伤的靶细胞，CFSE+PI+

PI

1.5.5

CFSE-PI+CFSE标记前

死亡的效应细胞。随着无水乙醇的浓度逐渐增加，

24孔板接种HepG2细胞，贴壁，至汇合度约为

80%，此时HepG2细胞数约为4X105/孔。以

2.5|imol/mL的CFSE标记10min,PBS洗1次，

1mL浓度为2X106/mL4X106/mL、

CFSE+PI+纟

渐增加（图1）。

2.1.2CFSE标记人肝癌HepG2细胞的毒性流式

细胞术检测结果表明，1~18h,各浓度CFSE标8X106/mL1.6X107/mL、3.2X10

7/mL、4X

107/mL的小鼠脾淋巴细胞悬液，以效靶比5:1、

10：1、20：1、40：1、80：1、100：1分

别作用6h12h和18h,收集细胞，PBS冲洗，

PI至终浓度为12.5|ig/mL,一

测细胞的存活率，

并按下式计算杀伤率。

杀伤率（％）=（阴性対照靶细胞存活率-试验组

HepG2细

18hCFSE

（2）。

2.1.3CFSE标记人肝癌HepG2细胞荧光强度的时

HepG2细

间动力学流式细胞术检测结果表明，1~18h,随

CFSEHepG2

12h

）/100%

MFI,6h

1.6

亍土s表示，用SPSS17.0软件包

后又有较小范围波动。在6~12h,以2.5|imol/mL

和5.0umol/mL的CFSE标记后的MFI{j

图1CFSE及PI对靶细胞区分效果

Figure1ThedifferentiatingeffectofCFSEand

PIontargetcells

Jun.2019，39(3)实验动物与比较更-学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine223

95

9

0

8

5

—•—0mol/L

-■-2.5mol/L

—*—5.0mol/L

x10mol/L

1718

时间/h

图2CFSE对人HepG2细胞的毒性

Figure2Thecytotoxicity

ofCFSE

to

humanHepG2cells

(图3),表明后续测定细胞杀伤活性时，效应细胞

6~12h

18h及

6h高；效靶比在40：1以上时，则杀伤率

随效靶作用时间的延长而增加。其中效靶比为

10：112h

2.2CFSE及PI7

流式细胞术检测结果表明，采用CFSE/PI双标

6h

6

(P<0.01),

记能有效分离杀伤实验所需各组：CFSE+PI-、

100：1

h

12h

CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-,其中CFSE+PI-

为未被杀伤的靶细胞，CFSE+PI+;

(P<0.05)(1)。

效靶作用时间相同时，细胞杀伤率总体随效靶

CFSEPI+；

胞和CFSE标记前死亡的效应细胞，CFSE-PI-为效

靶相互作用过程中存活的效应细胞(图4)。

比的增加而增加，但效靶比在10：1至80：1间

无显著性养异，直至效靶比上升至100：1时，杀

:

效靶作用时间为6h

12h时

100：1与10：1

(P<0.01)(表1)。

2.3:

流式细胞术检测结果表明，效靶比在5:1至

40：1

比100：1与10：1相比有显著性养异(P<0.05),

12h

2

00

o

1000

0

图3CFSE对人HepG2细胞荧光强度的时间动力学曲线

Figure3ThetimedynamicsoffluorescentdensityofCFSE-labeledhumanHepG2cells

224实验动物与

比较更-学LaboratoryAnimalandComparative

Medicine

<

,

a)

p

-

p

o

-

Jun.2019，39(3)

5

50K100K150K

200

K250K。

lu

n

-p

a

O

Jd

wap-po-:

:

E

4

10

10

10

0

3

.2

p

-s.

0

J

d

O

6.

E

6

3

10

FSC-AComp-CFSE-A::CFSE-A

图4CFSE及PI对效靶细胞区分效果

Figure4

Thedifferentiatingeffect

ofCFSEandPIoneffectorcellsandtarget

cells

表1效靶作用时间及效靶比对细胞杀伤率的影响

Table1Theeffectofaction

timebetween

effector

andtarget

cellsandtheeffector

totargetcellratiosonthespecific

cellular

killingactivity

效靶作用

时间/h

效靶

%

比

6

12

18

5：1

34.61土2.29

38.64土0.05

36.90士9.06

10：1

35.32±1.80

20:1

39.74士5.67

48.86土6.23

43.392.51

40：1

39.93士7.39

80：1

44.34±6.63

50.52土13.12

63.727.62

10:1

100:1

50.41土3.53AA

48.78土2.49**

45.798.49

43.65土4.54

43.58

5.31

,

63.60土4.95*人

65.49±8.11

,

A

P<0.05,P<0.01

:,6h,*P<0.05,*P<0.01;

3讨论

在建立既能保留肿瘤生物学特性，且免疫

的各浓度CFSE对人肝癌HepG2细胞未见明显毒

CFSEHepG2细

MFI6~12h,且效靶作

动力学分析表明，2.5pmol/mL和5.0pmol/mL的

功能相対正常的人肿瘤异种移植动物模型的过程

中，我们需要找到一种方便操作的检测小鼠脾细胞

对人肿瘤细胞杀伤作用的方法以应对较大的检测需

[10]51CrLDHELISPOT

MHC四]

CFSE

12h6h,丿

12ho

10：1100：1「

,i

能完全满足本实验对杀伤作用检测的要求。,

10:1

HepG2细胞,贴壁，

,I

:24流式细胞术是利用流式细胞仪进行的一种高速

单细胞定量分析和分选技术，能对检测的每个细胞

进行多个参数的检测。本实验通过采用适当的不同

荧光染料

，即可有效区分多种细胞及其存活状态，

80%时

，以

2.5pmol/mL的CFSE标记10min,PBS洗1次，加入

含10%DMEM

,而流式细胞术这种基于单细胞水平上的检测手段也

保证了多种细胞共检测时各种细胞间数量羞距较大

10:112h,收

集细胞，PBS,加入PI至终浓度为12.5pg/mL,

时检测的准确性和可靠性。

本文对流式细胞术检测小鼠脾细胞对人HepG2

上流式细胞仪检测细胞的存活率，并计算杀伤率。

本方法可有效、精确评价小鼠脾淋巴细胞对人

肝癌HepG2细

打下了基础。

细胞杀伤活性的方法进行了初步的标准化探讨：

CFSEPI)

Jun.2019,39(3)实验动物与比较更-学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine225

参考文献：

[1]AparicioS,HidalgoM,KungAL.

Examiningtheutility

of

patient-derivedxenograftmousemodels

[J].Nat

Rev

Cancer,

2015,15(5):311-316.

[2]Desmond-HellmanS，lanslargecenterfor

PDXmodels[J].

CancerDiscov,2014,4(2):136-137.

[3]AdaGL，nal-selectiontheory[J].Sci

Am，

[6]卫江波，徐然然,付志浩，等.疫苗诱导的特异性细胞杀伤

活性检测方法的建立[J].中国生物制品学杂志,2012,

25

:1680-1683.

(12)

[7]包晶晶，

林海霞,马璟.CFSE标记技术的研究进展[J].免

疫学杂志,2010,5:461-464.

[8]BocharovG,LuzyaninaT,CupovicJ,et

tryof

celldivisioninCFSE-Basedlymphocyteproliferationanalysis

[J].FrontImmunol,2013,4:264.

1987,257(2):62-69.

[4]+：甫厚，陈绍先,郭彩云，等.LDH释放法测NK细胞毒的

方法学研究[J].中国免疫学杂志，1990(2):115-117.

[9]刘英杰，

李景华.低浓度乙醇对人肝癌HepG2细胞的杀

伤作用[J].解剖学报,2016,47(2):228-233.

[5]童骁，沈铁，梁华，等.利用流式细胞术测定CTL活性方法

在EIAV免疫学中的应用[J].中国病毒学,2005.20(6):642-

[10]李姗姗，舒旳

，陈來,等.妊娠小鼠了宫内胎鼠腹腔注射人

肿瘤HepG2细胞对胎鼠生长发育的影响[J].中国比较医

学杂志,2018,28(7):33-42.

646.

DevelopmentofaMethodfor

DeterminationofCytotoxicityActivity

ofMouseSplenicLymphocytesonHumanHepG2Cells

CHENLi-Ling,ZHONGYou-Bao,LIUXuan,CHENLai,YUANKe-Wang,HUANGLi-Ting,LIShan-Shan

(JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

[Abstract]ObjectiveTodevelopamethodforevaluationofthecytotoxicityactivityofmicesplenic

lymphocytestohumanHepG2cellsbasedonflowcytometry(FCM),inadditiontoensuretheefficiency

ofevaluationofthecytotoxicityactivityofmicespleniclymphocytestohumanHepG2cellsinthe

processofestablishingananimalmodelofhumantumorxenotransplantation,whichcanpreservethe

biologicalcharacteristicsofhumantumors,meanwhile,hasrelativelynormalimmunefunction.

MethodsHumanHepG2cellswerelabeledwithCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidyl

ester)andtreatedwithanhydrousethanoltomimicthecytotoxiceffectofcytotoxickillercells,then

determinedbyFCMafterpropidiumiodide(PI)staining,basedonwhichtheconcentratiofCFSEand

phocyteswereisolatedfromspleenofmiceaseffector

durewasdevelopedbased

ontheoptimizationof

conditsThecellswere

dividedintoCFSE+PI-,CFSE+PI+,CFSE-PI+andCFSE-PI-groupsbyCFSE/PIstaining,andthesurvival

/mL,theoptimalaction

timebetweeneffectorandtargetcellswas12h,and

theeffectortotargetcellratiosof10：1was

siAmethodforevaluationofthekillingactivityofmicespleniclymphocytesto

humanHepG2cellsbasedonFCMwassuccessfullydeveloped,whichprovidedareferencefor

evaluatingthekillingeffectofanimalspleniclymphocytesonxenogeneiccells.

[Keywords]Mouse；Spleniclymphocytes；HumanHepG2Cells；Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl

ester(CFSE)；Propidiumiodide(PI)；Flowcytometry(FCM)；Cytotoxicityactivity