•144•JournalofMinimallyInvasiveMedicine,Apr.,2018,Vol.13,No.2

胶原水凝胶与基质胶作为骨组织工程支架

材料表面涂层修饰效果的比较研究▲

朱永佳12靳攀2何熠2缪志康2韦庆军12*

(1广西医科大学第一附属医院；广西生物医药协同创新中心，南宁市530021)

【摘要】目的对比研究胶原水凝胶和基质胶作为骨组织工程支架表面涂层材料的效果。

方法本实验借助原代成骨细胞，通过对碱性磷酸酶(ALP)活性、组织学染及成骨特异性mRNA水

平的分析，研究胶原水凝胶和基质胶对成骨分化的影响。结果胶原组与基质胶组细胞活力以及增殖

能力均增强,并上调成骨相关基因及蛋白，包括碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素（OCN)、骨桥蛋白（OPN)和

I型胶原蛋白（COL1A1),尤其是胶原水凝胶涂层对细胞生长和成骨分化的促进作用明显大于基质胶

涂层。结论胶原水凝胶涂层比基质胶涂层更有利于成骨分化，更适合作为细胞支架,推荐其作为骨

组织工程支架材料的常用表面涂层材料。

【关键词】胶原水凝胶;基质胶;成骨细胞;细胞表面支架

【中图分类号】R602【文献标识码】A【文章编号】1673~6575(2018)024)1444)5

DOI：10.11864/.1673.2018.02.04

ZHUYongjia1，JINPan,HEYi，MIPOZhikang，WEIQingjun，2

(theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity；GuaagxiCollaborativeennovatiooCenterforBiormdi-

cine,Nanning，Guangxi530021，China')

【

Comparisonofmodificationeffectbetweencollagenhydrogelandmatrigelassurface

coatingofscaffoldmaterialsforbonetissueengineering

Abstract】ObjectiveTocomparethemodificationeffectbet-weencollagenhydrogelandmatrigelas

sThealkalinephosphatase(ALP)

activity,hitologicalstainingandmRNAlevelofosteogenicspecificgeneswereanalyzedintheprmar

osteoblasts,thentheeffectsofcollagenhydrogelandmatrigelonosteogenicdifferentiation

ResultsInthecollagengroupandmatrigelgroup，thecellvitalityandproliferativecapacityincreased，the

osteogenicrelatedgenesandproteinsincludingALP,osteocalcin,osteopontinandalpha1type

gwiththecollagenhydrogelpromotionwasmoreeffectiveinpromotingthecellgrowthand

sionCoatingwiththecollagen

hydrogelismorebeneficialtoosteogenicdifferentiationandismoresuitableforimprovementof

comparedtocoatingwithmatrigel，andisrecommendedasassurfacecoatingofscaffoldmatedalsforbone

tissueengineerng.

[Keywords】Collagenhydrogel;Matrigel；Osteoblast；Cellsurfacescaffold

骨缺损是骨科手术的挑战。骨替代物，支架的作用

是创造细胞微环境进而模拟体内情况，并影响着增殖、

分化和凋亡等细胞过程的必要条件。天然骨组织包括

羟基磷灰石（HA)和胶原蛋白。目前胶原材料已引起人

们的广泛关注且用于骨组织工程。I型胶原蛋白具有良

好的生物相容性，可作为大分子药物缓慢释放的载

体[^]，其制作方法包括矿化[3]、热触发组装[4]、真空渗

▲基金项目：国家重点科技攻关计划（编号：

2016YFB0700804);国家自然科学基金（编号：81472054);国家

自然科学基金（编号:81560371);广西科技攻关项目发展基金

(编号:GuikeAB16450003);广西高校高层次创新团队和优秀学

者（第三批）项目。

2通信作者

透[5]、冻干及超临界点干燥[6]。基质胶，是一种基底膜

提取物，被广泛应用于肿瘤转移的研究中[]，其表面涂

前针对这两种材料的比较研究尚未有报道。

本研究通过碱性磷酸酶检测、组织学染以及

层可用于提高支架的成骨活性等生物学功能[84]，但目#$2018%第13'第2(

JournalofMinimallyInvasiveMedicine,018,3(2)

RT-PCR检测成骨特异性基因的表达水不比较胶原水凝

数"

•145•

有限公司）进行细胞。最后用中性树胶密封，用倒

置相差显微镜观察并拍照。

1.5ALP染和ALP活性测定按说明书分别用ALP

染试ALP检测试

胶及基质胶的效果，以此来

涂层料。现报告如下。

的骨组织工

（均购自南成>

1材料与方法

，且后续操作均获得广

脱处死SD

工程研究所）进行2、4、6d碱性磷酸酶（ALP)染和

ALP细胞活性测定，观察

1.1原代成骨细胞的分离提取3~7d日龄SD鼠

购自广西医科大学实验动

鼠，

医科大学伦理委员会批准。用

情况并用倒置相差显微镜

拍摄图像。同时，用不含蛋白酶抑制剂（mM)的细胞

裂解液（RAPI)提取每个样品的总蛋白，在12000rpm

离心15mi后，

标准液、显

检测吸光度值，随后将值

3次。

1.6

养基的上用于检测。加人试

后，用酶标仪在520nm处

成金氏单位，实验重复

境下用布取出顶骨，浸于磷：

(PBS)中，然后用0.25%胰蛋-乙二胺四乙

(EDTA)U宝技术有限公司）在37°C消

化30mm除去结缔组织及骨膜。将顶骨剪成1mm3的

碎片后，用I型胶原酶（Gibco,ThermoFisherScientific，

Inc..Waltham，MA，USA)37C下孵育4h。800g离心

茜素红染培养2、4、6d后，用PBS洗涤细胞，

用4%多聚甲醛（PFA)固定30min,并在37°C用1mL

后，用

行像

除

。

料，用倒置相差显微镜进

5mi后，将细胞

Gico)和1%

于

/ft

10%(v/v))

溶液（（

(FBS，

100U/mL，链

0.1%茜素红S(Sigma，USA，PH8.3)持续染30min。

霉素100U/mL)的培养基中，置于37°C5%C〇2培养箱

养，选择第3代细胞用于后续实验。

1.2水凝胶制备和细胞接种胶原水凝胶储备液呈酸

性，不利于细胞。为得细胞的水溶

，化钠溶人的凝胶储

中至pH7.0。基质胶（BectonDickinson，USA)在4C环

境下融化至液态。在24孔板中加人20^L凝胶及在

6孔

胞养。

1.3细胞活性检测细胞活性通过荧光素二乙酯

3次后，将细胞与2^M

(FDA，GenwayBiotechInc，USA)/鹏化丙陡（PI，Sigma，

USA)染检测。用PBS;

FDA和2mg/LPI室温避光环境中分别温育5rmn，后通

1.7免疫组化检测将细胞用4%多聚甲醛固定

酶，与在37^温育30出1。|特结

30min,加人3%H2〇230min以消除内源性过氧化物

合。用I型胶原（1:100，Boter，武汉）抗体在4C孵育

用DAB孵育并用苏木精复染后，将细胞风干，

封，并用置相差显微镜。

2

脂

后，加人Cy3-抗-兔IgG二抗（1:100，Boster，武汉）。

人100|xL凝胶，均于底部，待固化后，

在24孔板及6孔板分别接种2x104细胞及5x104细

1.8RNA的提取和qRT抗CR检测用qRT-PCR检测

骨形态发生蛋白2(Bmp2)、runt相关转

(Runx2)、碱性磷（八1)、骨钙素（0〇〇、骨桥蛋白

(Opn)和1

取试

蛋白（Colla1)的表达。使用RNA提

（Megentec,广州）提取总RNA。从1pgRNA

开始，使用FastStartUniversalSYBRGreenMasterMix

((nvitrogen，CA，USA)扩增的逆转录试剂盒（Fermentas

见表1。通过使用比较2-AACt方

化为Gapdh。复3次

基

过激光共显微镜（LSCM，NikonA1，Japan)拍

像。

1.4细胞形态分析培养2、4、6d后，经多聚甲醛固定

30mi，并依次用苏木精-伊红（HE，南成技术

1

基因名称

正向引物

Company,USA)合成2jxgcDNA。本实验中使用的引物

达标准

少标准差。

PCR引物序列表

反向引物

Gapdh

Bmp2

RunX

Alp

Ocn

Opn

Colla1

1.9

5，-GGCTCTCTGCTCCTCCCTGT抗，

5，-CTGTGCCGTTGAACTTGCCG抗，

5，-GTGGCCAGGTTCAACGATCT抗'

5，-GTTACAAGGTGGTGGACGGT抗，

5，-GGCGCTACCTCAACAATGGA抗，

5，抗CACTCCTCGCCCTATTGGC抗，

5，抗GACCTCAAGATGTGCCACT抗，

2

2.1

5、TGCTCAGCTTCCATCACGAA兔，

5，抗ATITTGAGCTGGCTGTGGC兔，

5、TGAGGAATGCGCCCTAAATCA兔，

5，抗CAGTGGTCAAGGTTGGCTC兔，

5，-GGCAACACATGCCCTAAACG兔，

5，兔CATTGATACAGGTAGCGCCT

5，兔CATCGGTCATGCTCTCTCC兔，

结果统计学分析所有数据均使用SPSS17.0软件进

行统计分析，计量资料以均数±标准差G±4表示，组

间比较使用单方差分析（AN0VA)和最小显著差异

(LSD)进行分析。以P<0.05为差统计学意义。

细胞活性检测通过FDAPI染测定细胞活性。

，死细胞成。与对如图1所示，活细胞染成•146•JournalofMinimallyInvasiveMedicine,Apr.,2018,Vol.13,No.2

s

u

n

o)

s

.E

>

0

A

J

>

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>

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10

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l

a>

y

组相比，胶原组和基质胶组中发活的成骨细

胞，组活细胞明显于基质组，明

成骨细胞活性具作用。

图4空白组、基质胶组及胶原组成骨细胞内碱性磷酸酶活性

检测（*代表尸<0.05，**代表尸<0.01，***代表尸<0.001)

图1空白组、基质胶组及胶原组的FDA/PI染（活细胞

显示绿，死细胞显示

2.2

，200x)

细胞形态分析HE染观察三组成骨细胞的形

(图2)。细胞质染成，细胞成。随时间

，各组成骨细胞数目，组细胞形态与

数目均优于其他组。

图2空白组、基质胶组及胶原组的HE染（200x)

2.3ALP染和ALP活性测定作为骨形成的标志

，ALP与成骨分化。组中ALP;度均随

(见图3)，组ALP;度明显高于

组。ALP活第2天至第6天持续，在胶

组为明显（见图4)。ALP:结果分析

均表明凝成骨细胞的。

>

dP

_

图3空白组、基质胶组组的碱性磷（200x)

2.4茜素使用来评估成骨细胞的

化结节，基质胶组组在第2天及第4天没有发

明显差异。然而，在第6天，与组和基质胶组相

比，胶原组明显化作用，其产的矿化

结节（见图5)。

图5空白组、基质胶组组的（200x)

2.5免疫组化检查I型胶原蛋白被认为是骨形成中

特的蛋白，本研究用免疫组织化学方法评估I

蛋白。结果显示，胶原组比组呈明显的阳性

结果

6

；同时，基质胶组中的阳达高于组（见

）。

1

|

祖

钿

I

f粲

暍

稍

I

l

l

链

t

图6空白组、基质胶组及胶原组的I型胶原免疫组化染

2.6

(200x)

基因表达分析成骨特异性基因AlP、〇cn和

Collal在蛋白组中明显上调（见图7)，表明

利于成骨;胶原组Collal的mRNA2018%第13'第2(

JournalofMinimallyInvasiveMedicine,018,3(2)

数•147•

4天到第6

达表明

源

的源分

相

涂层

引发

。

，本研究发现，与基质胶涂层比较，胶原水

利于骨形成且

涂层材料。

在骨组作

料，推荐其作为骨组织工

的

细胞分化，胶原蛋白的

导基因编蛋白

表明胶原可以通过外源性添加触发内源基因编码程序。

。实验中检测的基因

上

凝胶涂层

为细胞

材料常用

参考文献

_

_.o'[1]MasalskasBF，MartinsJuniorW，LeoniGB，e­

c.c

*.

'

o.6

.0

w.0

'

_

'•*l

i

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图

(*

7Bmp2、Runx2、Alp、Ocn、Opn和Collal的相对表达情况

代表尸<0.05,**代表尸<0.01，***代表尸<0.001)

3讨论

胶原水凝胶及基质胶均具有良好的生物相容性和

低的细胞毒性，有助于创造一个复杂的的细

胞微环境，作为表层细胞涂层使

用[7]。然而，目前还没有研究比较它们对细胞成骨分化

的。

1所示，的推移，成骨细胞在涂

层比在基质胶涂层数量增加更显著，demon丨

涂层在细胞生存方面比基质胶涂层[0]。与

FDATI染一致，更多的细胞聚集在涂层上，尤其

是第4〜6天（图2)。由成骨细胞产生并参与到天

磷的降解，为矿化的发生提供足够的磷酸盐

或磷，ALP通常作为成的标记来成

骨分化的程度[4]。图3中的ALP染和图4中的

ALP活性分析明在胶原组的ALP分泌，这

与图7中Alp的mRNA—致。图5显示第6天的

化结节，证实种涂层方法的成骨效

应。I作为细胞外基质的主象，细

胞的附着、增殖和分化[1^4]。在图6中，利用免疫组织

化学检测到的I型胶原蛋，与图7的基

达相一致。骨钙素（Oc)和骨桥蛋白（Opn)都是成骨分

化的特征性标志物。Ocn是一种由成骨细胞分泌的特

蛋白，是骨细胞分化的标志[5]。Opn被认为是

细胞粘附，其分泌主要在骨形成的早期阶

段[6]。7所示，Oc从第2天到第6续，而

Opn在第2天达值，与前期研究一致[5]。BMP-2信

号通路是调节骨再生的主要通路之一[17]，并通过BMP/

Smad信号通路调节Runx2的表达[1―測。本研究

中，胶原组BmP2和Runx2在第2天显著上调了，并在第

liveryofstrontiumranelatepromotesregenerationofcritical

sizebonedefectsfilledwithcollagensponge[J].JBiomed

MaterResA，2018，106(2):333-341.

[2]GhicaMV,AlbuKayaMG,Dinu-I>ii*vuCE,p­

ment,OptimizationandInVitro/InVivoCharacterizationof

Collagen-DextranSpongiousWoundDressingsLoadedwith

FIufenamicAcid[J].Molecules，2017,22(9):pii:1552.

[3]LawsonAC,en-calciumphosphate

composites[J].ProcInstMechEngH,1998,212(6)：

413-425.

[4]PedersonAW,RubertiJW,las­

semblyofabiomimeticmineral/collagencomposite[J].

Biomaterials,2003,24(26)：4881-4890.

[5]WernerJ，Linner-KrcmarB，FriessW,ical

propertiesandinvitroccllcompatibilityofhydroxyapatite

ceramicswithgradedporestructure[J].Biomaterials，

2002,23(21)：4285-4294.

[6]NieL，ChenD，SuoJ，ochemicalcharacteriza­

tionandbiocompatibilityinvitro,ofbiphasiccalciumphos­

phate/polyvinylalcoholscafoldspreparedbyfreeze-dryig

methodforbonetissueengineeringapplicati[J].

ColloidsSurfBBiointerfaces，2012，100:169-176.

[7]BentonG，ArnaoutovaI,GeorgeJ,el：fromdis­

coveryandECMmimicrytoassaysandmodelsforcancer

research[J].AdvDrugDelivRev,2014，79-80:3-18.

[8]JungYJ,KimKC,HeoJY,ionofAngiogenesis

byMatrigelCoatingofVEGF-L^oadedPEG-ZPCL-BasedHy­

drogelScafollsforhBMSCTransplantation[J].MolCells，

2015,38(7):63-668.

[9]WangM,DengY,ZhouP,ocultureanddirect­

edosteogenicdifferentiationofhumanpluripotentstemcells

onpeptides-decoratedtwodimensionalmicroenvironment

[J].ACSApplMaterInterfaces，2015,7(8)：4560-

4572.

[10]JiangT，ZhouB，HuangL，rapholideExerts

Pro-OsteogenicEffectbyActivationofWnt/(3-CateninSig­

nalingPathwayinVitro[J].CellPhysiolBiochem，2015，

36(6)2327-2339.

(下转第151页）#$2018%第13'第2(

JournalofMinimallyInvasiveMedicine,018,3(2)

2015,8(10)：1357-1359.

[5]徐志坚，骆辉珍，钟晓燕，等.C〇2激光鼓膜造孔与鼓膜置

在治疗鼻咽癌放疗后分耳炎的研究[].

中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2017，25(1):37-40.

[6]Mujica-MotaM,WaissbluthS,teristicsof

radiation-inducedsensorineuralhearinglossinheadand

neckcancer：asystematicreview[J].HeadNeck,2013,

35(11)：1662-1668.

[7]PetsukiriJ,SermsreeA,ThephamongkholK,i­

neuralhearinglossafterconcurrentchemoradiotherapyin

nasopharyngealcancerpatients[J].RadiatOncol,2011,6：

19.

[8]蒋朝阳，张伶，潘兴国，等.晚期鼻咽癌调强放疗中内

耳评价[J].现代肿瘤医学，2016,24(5):809-

812.

[9]HerrmannF,DorrW,ectivestudyonradi­

ation-inducedchangesinhearingfunction[J].IntJRadiat

OncolBiolPhys，2006,65(5):1338-1344.

[10]ZhengY,HanF,XiaoW,isoflatetoxicityin

nasopharyngealcarcinomapatientstreatedwithintensity

modulatedradiationtherapy[J].RadiationOncol，2015,

(上接第147页）

[11]NaK，KimSW，SunBK，enicdifferentiationof

rabbitmesenchymalstemcellsinthermo-reversiblehydrogel

ctructscontaininghydroxyapatiteandbonemorphogenic

protein-2(BMP-2)[J].Biomaterials,2007,28(16)：

2631-2637.

[12]LiY,JiangT,ZhengL,enicdifferentiationof

mesenchymalstemcells(MSCs)inducedbythreecalcium

phosphateceramic(CaP)powders：Acomparativestudy

[J].MaterSciEngCMaterBiolAppl,2017,80：296-

300.

[13]HaimovH,YosupovN,PinchasovG,rphoge­

neticProteinCoatingonTitaniumImplantSurface：aSys­

tematicReview[J].JOraHMaxllofac,2017,8(2)：e1.

[14]Viguet-CarrinS,GarneroP,eofcolla­

geninbonestrength[J].OsteoporosInt,2006,17(3)：

319-336.

[15]NakamuraA,DohiY,AkahaneM,alcinsecre­

tionasanearlymarkerofinvitroosteogenicdifferentiation

ofratmesenchymalstemcells[J].TissueEngPartCMeth­

ods,009,5(2)：169-180.

[16]MckeeMD,PedrazaCE,ontinand

放疗后分泌性中耳炎的疗效对比[J].中国临床研究，

数"

•151•

10:17.

[11]XiaoWW,HuangSM,HanF,ontrol,survival,

andlatetoxicitiesoflocallyadvancednasopharyngealcarci­

nomatreatedbysimultaneousmodulatedacceleratedradio­

therapycombinedwithcisplatinconcurrentchemotherapy：

long-termresultsofaphase2study[J].Cancer,2011,

117(9)1874-1883.

[12]TanPX，DuSS，RenC，ion-inducedCochlea

haircelldeath：mechanismsandprotection[J].AsianPac

JCancerPrev，2013,14(10):5631-5635.

[13]SelzerE,rinciplesofmoleculareffectsof

irradiation[J].WienMedWochenschr，2012，162(3-4)：

47-54.

[14]Honor6HB,BentzenHB,MollerK,y-neural

hearinglossafterradiotherapyfornasopharyngealcarcino­

ma：individualizedriskestimation[J].RadiotherOncol,

2002,65(1)：9-16.

[5]胡莉，江浩.头颈部肿瘤放疗致听力损伤的研究

展[J].现代肿瘤医学，2017,25(8):1322-1324.

[6]蒋朝阳，高辉，张伶，等.50例鼻咽癌调强放疗中内

耳受量评价[J].现代肿瘤医学,017,25(6):944-948.

(收稿日期：018-1-11修回日期:2018-3-10)

[17]

[18]

[19]

[20]

woundhealinginbone[J].CellsTissuesOrgans,2011,

194(2-4)313-319.

BenischP，SchillingT，Klein-HitpassL，n­

scriptionalprofileofmesenchymalstemcellpopulatiin

primaryosteoporosisisdistinctandshowsoverexpressionof

e5142.

osteogenicinhibitors[J].PlosOne,2012,7(9)：

HanaiJ,ChenLF,KannoT,ctionandfunctional

cooperationofPEBP2/isticinduc­

tionoftheimmunoglobulingermlineCalphapromoter[J].

JBiolChem,1999,274(44)：31577-31582.

JavedA,BarnesGL,JasanyaBO,mologdo­

maintranscriptionfactors(Runx,Cbfa,andAML)mediate

repressionofthebonesialoproteinpromoter：evidencefor

promotercontext-dependent,activityofCbfaproteins[J].

MolCellBiol,2001,21(8)：2891-2905.

NishimuraR,HataK,HarrisSE,-bindingfactor

alpha1(Cbfa1)inducesosteoblasticdifferentiationof

C2C12cellswithoutinteractiwithSmad1andSmad5

[J].B〇ne，2002,31(2):303-312.

(收稿日期：018-1-16修回日期:2018-3-12)