许多未培养的微生物在调节地球的生物地球化学过程中扮演着不为人知的角色; 从调节植物健康到在陆地和海洋环境中推动养分循环，以及可能影响全球气候的过程。虽然研究人员正在利用多种方法来识别这些被称为“微生物暗物质”的微生物，并确定它们正在做什么，但大多数技术都不允许它们同时进行这两种微生物。

在网上公布2016年6月28日，一项研究的美国国家科学院学报(PNAS)，研究人员在加利福尼亚技术学院(加州理工学院)和能源部联合基因组研究所，美国能源部(DOE JGI)的美国能源部办事处科学用户设施，利用最近改进的技术来识别个体活跃细胞，以及微生物群落内的活跃细菌和古细菌的单个聚类。了解地球微生物多样性的真实范围是DOE感兴趣的，以便了解如何利用它们来应对各种能源和环境挑战。

“探索微生物暗物质的最大问题之一是到目前为止，确定何时未培养的微生物具有代谢活性以及它们在系统中的生态功能是非常复杂的，”研究第一作者Roland Hatzenpichler说，他是博士后研究人员在加州理工学院微生态生态学家Victoria Orphan工作。作为DOE生物与环境研究(BER)计划的一部分，Orphan的实验室一直在研究未培养微生物的生态学和生理学，催化环境中甲烷的厌氧氧化。“当我们处理生活在复杂社区内的环境或寄主相关生物 - 通常同时发生数千种或更多种 - 时，很难确定个体物种或细胞的作用。历史上，这已经使用单细胞分辨同位素标记来实现。这是一种相对繁琐且昂贵的方法，但是非常具体和敏感。但是，如果我们想要更好地理解微生物组功能我们需要新的，互补的方法，更高通量，可以并行化，并且便宜。BONCAT [新技术]就是这样一种方法。“

BONCAT：了解微生物体功能的高通量技术

BONCAT是生物正交非标准氨基酸标记的缩写，是加州理工学院开发的用于生物工程研究的技术，但由Hatzenpichler和Orphan改编用于微生物生态学研究。BONCAT使用合成氨基酸标记蛋白质制造细胞。然后可以用荧光标签对这些氨基酸进行染色，在其栖息地中点亮活性细胞。在这项研究中，Hatzenpichler及其同事使用从俄勒冈州和加利福尼亚州沿海地区的深海甲烷渗漏沉积物中收集的沉积物样本进行了一系列孵化实验，追踪甲烷代谢细菌和古菌种群的缓慢生长。

加州理工学院的研究人员将BONCAT与荧光原位杂交(FISH)相结合，分析这些模拟环境中的活性微生物，并确定它们在哪些条件下具有活性。“通常，每个甲烷渗漏部位都有几个不同的古菌甲烷氧化剂，”Hatzenpichler说。“一个长期存在的假设是，来自这些群体的不同成员在不同时间具有不同的活性。通过利用以相对高通量模式进行BONCAT分析的能力，我们发现所有甲烷氧化古菌群的成员都是合成活性的在孵化期间。现在我们可以开始问为什么了。“

应用BONCAT技术进行流式细胞术

然后，DOE JGI研究人员帮助开发了一个流程，使团队能够将BONCAT应用于流式细胞仪。“这与单细胞基因组学的过程相同，但对于共生细菌和古细菌的聚集，”DOE JGI微型应用组负责人Rex Malmstrom称该技术称为BONCAT-FACS(BONCAT - 荧光激活细胞分选)。“我们正在对在模拟环境中活跃的细胞的单个聚集体进行分类，并且通过细胞分选仪我们可以抓取活性细胞来研究它们。我们必须弄清楚如何调整流式细胞仪的过程。排序后，我们对单个聚集体进行全基因组扩增，然后对16S rRNA标记基因进行测序，以鉴定包含聚集体的细胞。我们现在对这些样本进行全基因组测序。“

通过BONCAT-FACS，研究小组发现，甲烷氧化古菌并不像已经预期的那样只与已知的硫酸盐还原菌相互作用，但有时也会与研究较少的Verrucomicrobia门的成员联系起来。之前没有发现过这些相互作用，研究结果表明，甲烷氧化古菌具有比人们想象的更广泛的共生关系。目前正在解决这些相互作用是否对两种细胞类型都有益的问题。

“JGI的主要力量在于能够破译微生物的遗传密码，”哈森皮奇勒说。“通过合作，我们能够从样本中分离出与温室气体甲烷降解相关的单个细胞群，确定参与该过程的细胞伙伴，并深入了解其遗传密码。” Orphan和她的团队计划利用配对的甲烷氧化古菌和细菌伴侣的基因组信息，深入了解在环境中共存的不同甲烷营养菌群之间的相互作用和能量交换的生理学和机制。

秋季，Hatzenpichler将在蒙大拿州立大学博兹曼分校开设自己的实验室。他将继续与DOE JGI研究人员密切合作，揭示未培养微生物的生物地球化学影响和生物技术潜力。