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在CRISPR基因组编辑中 Cpf1证明了其显着的特异性并产生了突变小鼠

2019-01-21 15:17:59 • 来源：

作为CRISPR基因组编辑的新工具，Cpf1因其与Cas9不同的属性引起了人们的兴趣：它只需要一个RNA，即CRISPR RNA组装更简单; 其交错的切割模式可以促进用所需的序列取代现有的DNA; 它识别富含胸苷的DNA序列，与Cas9识别的富含鸟苷的序列相比，它的研究较少。总之，Cpf1有望扩大CRISPR基因组编辑目标位点的范围，提高效率。尽管Cpf1作为一种强大的基因组编辑工具具有巨大的潜力，但很少有人证明新工具如何找到其目标。在6月6日在线发表在Nature Biotechnology上的一系列论文中，韩国IBS基因组编辑中心的研究人员将Cpf1作为一种高度特异性的可编程工具，适用于精确基因组编辑，并报告使用CRISPR-Cpf1生成突变小鼠。

在CRISPR基因组编辑中 Cpf1证明了其显着的特异性并产生了突变小鼠

研究人员使用了两种类型的Cpf1家族蛋白(AsCpf1和LbCpf)，因为它们是同类中最有效的，并进行了Digenome-seq：他们设计的一项测试，用于识别预期(目标)和非预期(脱靶)位点。研究人员希望Cpf1在整个基因组中进行切割。从预先组装的重组Cpf1 RNP切割从人细胞分离的无细胞基因组DNA，并进行全基因组测序。通过计算鉴定对应于靶标和脱靶体外切割位点的序列读数的均一比对。

全基因组分析表明，与Cas9相比，Cpf1具有高度特异性，显示出较少的脱靶切割位点(LbCpf1为6，AsCpf1为12)，在人类基因组中> 90个位点切割(图1a)。具体而言，在大多数体外切割位点，indel(代表脱靶效应)低于0.1%，远低于相应的靶标位点，表明两种Cpf1蛋白几乎没有脱靶效应。“值得注意的是，针对特定位点的LbCpf1和AsCpf1仅切割整个人类基因组中的靶标位点”，该研究的第一作者之一KIM Daesik说(图1b)。

“为了减少脱靶效应，我们将预装配的Cpf1 RNP引入细胞，假设Cpf1 RNP与Cas9 RNP类似，在转染后立即切割靶位点，并会被破坏蛋白质的内源酶快速降解，从而减少 - 在不牺牲目标效应的情况下实现目标效果。“ KIM Jin-Soo说，两篇论文的通讯作者和IBS中心主任。实际上，Cpf1 RNPs没有诱导任何足够高的插入缺失以在非靶位点产生突变(图2)。

显示Cpf1显着的特异性，来自同一IBS中心的另一个研究小组成功地将Cpf1 RNP介导的突变引入小鼠胚胎：研究人员针对Foxn1(调节免疫系统的转录因子，包括皮肤毛发的生长)，以及酪氨酸酶(一种催化黑色素生成的酶，黑色素是一种决定皮肤颜色的天然色素)。该研究的第一作者HUR K Junho说：“数据显示Cpf1 RNP向小鼠胚胎的分娩导致了高突变频率的预期遗传功能，分别为64%和33%。我们将突变小鼠胚胎移植到替代品中母亲和获得有针对性突变的小鼠。突变分别导致无毛和白发小鼠(图3a)。赫尔补充道，“ 为了研究Cpf1是否具有脱靶效应，我们使用从一个Foxn1突变小鼠及其野生型同胞中分离的基因组DNA进行全基因组测序。序列分析显示没有发生脱靶突变。其他突变体的靶向深度测序也显示没有脱靶突变“

在这项研究中，研究人员使用电脉冲将Cpf1 RNP 同时渗透到多达50个小鼠胚胎中(图3b)。这种新的电穿孔提供了用于产生突变动物的基因组编辑分子。与常规显微注射相比，电穿孔方法易于实施，快速且可扩展。

将Cpf1添加到其工具箱中，CRISPR编辑技术可以构建更多样化的鼠标模型。IBS基因组编辑中心主任兼两位研究的相应作者KIM Jin-soo评论说：“由于这两项研究证明了Cpf1的优越特异性，这种新的核酸酶将被更广泛地用于精确的基因组编辑，而不是CRISPR Cpf1的应用不会受到限制，但仍然保持开放，从治疗性治疗开始，如无毒性癌症药物，干细胞治疗，高附加值牲畜和农产品。“

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