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发展出更多功能的CRISPR-Cas9

2019-04-26 11:06:54 • 来源：

对于Cas9在研究和治疗方面的所有潜力，它以及CRISPR相关家族中的其他酶具有局限性。为了识别并结合DNA序列，Cas9需要特定的一段基础字母来伴随目标。该要求使得酶的大部分基因组不可接近，显着降低了其应用范围。

发展出更多功能的CRISPR-Cas9

但麻省理工学院和哈佛大学布鲁德研究所，哈佛大学和霍华德休斯医学研究所(HHMI)的一组研究人员已经开发出新的Cas9变体，它们与更广泛的所需基地兼容，可以进入更多地区。基因组。更重要的是，这些新版本的蛋白质比以前的版本更准确地编辑它们的目标。

该研究结果在本周的描述自然。

“我们通过扩大Cas9的兼容性部分解除了序列限制，因此它可以'看到'更多的基因组，”资深作者David Mer，Merkin医疗保健变革技术研究所所长Richard Merkin教授和核心研究所说。广泛研究所成员，哈佛大学化学与化学生物学教授，HHMI研究员。“为临床和研究应用开发CRISPR技术有很多努力，我们希望这项工作增加了特定感兴趣的网站可以访问的可能性。”

Cas9传统上需要的碱基序列称为PAM，用于“原型间隔相邻基序”。最终，如果基因组中感兴趣的位点附近不存在PAM，则天然CRISPR酶无法获得它。即使是迄今为止发现的最通用的Cas9酶，来自化脓性链球菌的SpCas9也无法获得近95%的基因组用于其任何应用(包括打开或关闭基因，DNA切割或碱基编辑)。这包括已知与人类疾病相关的大约四分之三的单碱基突变。

“即使对于SpCas9，PAM的要求也会对CRISPR的使用造成严重的瓶颈，”刘说。“如果您正在尝试一种需要非常精确定位蛋白质的CRISPR应用程序，那么您需要幸运的是在正确的位置安装PAM。”

为了创建具有更多PAM选项的SpCas9变体，该团队使用了一种称为噬菌体辅助连续进化(PACE)的系统，该系统于2011年在哈佛的刘实验室开发。在工程化噬菌体和细菌的生态系统中，PACE应用进化压力来鼓励噬菌体产生具有所需性状的蛋白质。

在这种情况下，噬菌体将Cas9基因携带到细菌中，细菌依次复制并突变Cas9 DNA。以前的研究已经修改了Cas9的特定部分(通常是已知接触DNA或指导RNA的部分蛋白质)，但PACE是独特且无偏的，因为它允许突变发生在整个基因上。

该系统经过工程改造，只有Cas9基因获得了能够结合其他PAM的突变时，噬菌体才能复制。一旦它发生，噬菌体可以将该基因的版本传递给新一代 - 这将感染更多细菌并重复循环。PACE的工作速度比其他蛋白质进化方法快100多倍，在进化过程中只需极少的人力。

PACE发现了许多形式的实验室进化的Cas9，或“xCas9”，但最优的一种可以开启基因组大约四分之一的位点，包括与人类疾病相关的近75%的点突变。Liu和他的同事在各种应用中展示了xCas9，包括打开基因，切割DNA和编辑单碱基对(C•G到T•A转换和A•T到G•C转换)。

最值得注意的是，尽管xCas9可以在基因组中看到更多的网站，但它的错误比自然的SpCas9更少。

“从科学角度来说，增加的特异性是最大的冲击，”刘说。“尽管如此，我们推测，野生型Cas9的脱靶活性是一种保护性的适应细菌以抵御不同变异的病毒 - 而且自然必须非常努力才能获得完全正确的氨基酸组合，因此Cas9可以容忍一些不匹配。所以如果你足够变异，这种酶可能会失去这种滥交。“

研究人员正在与其他实验室合作，以确定xCas9更高DNA特异性的分子基础，并继续使用PACE平台进化具有额外PAM兼容性的新酶变体。

“希望最终，我们将拥有一个Cas9或其他CRISPR酶解决方案的大书架，”刘说。“在我们能够访问人类基因组中的每个可能位点之前，我们在这一研究领域的努力从未真正结束。”

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