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改进的Cas9酶减少了脱靶CRISPR突变的机会

基因组学专家正在寻找新方法来改善Cas9酶在CRISPR基因编辑中的应用,以减少脱靶突变的可能性。这项研究解决了对脱靶诱变的担忧,并确定了提高精确度的新方法,该研究最近在休斯敦举行的美国人类遗传学会 2019年年会上发表。

改进的Cas9酶减少了脱靶CRISPR突变的机会

什么是Cas9?

基因组或基因编辑使科学家能够通过在基因组中特定位置添加,去除或改变遗传物质来改变生物体的DNA。一个在实验室中使用的更近的基因编辑技术是CRISPR-Cas9。

研究人员创建了一条带有短“指导”序列的RNA,该序列可以识别并结合特定的靶DNA序列。指导RNA还与酶Cas9结合,后者又与靶DNA结合并在预期位置切割。一旦切割了DNA,研究人员就可以添加或删除遗传材料,或通过用定制的DNA序列替换DNA片段来对其进行更改。

多伦多现象基因组学中心的副主任Lauryl Nutter和多机构敲除小鼠表型研究计划(KOMP2)的合作者经常使用Cas9基因编辑来生成具有特定突变的小鼠品系。

在实验室中进行这种基因编辑过程时,他们常常想知道脱靶诱变的风险是什么–将意外的基因突变引入其小鼠品系。

“我们想知道:我们需要在多大程度上担心脱靶诱变?” 纳特说。

改善人类基因编辑

研究小组希望,如果他们能够确定小鼠问题的严重程度,那么将有助于他们更好地评估人类细胞系中的问题,并找到新的方法来提高基于Cas9的基因编辑的准确性。

为了进行调查,Nutter及其团队使用Cas9进行了58个基因组编辑实验,并指导RNA诱导特定的靶向基因突变。每个实验中使用2至4个向导,总共增加了175个不同的向导RNA。

研究人员对每只小鼠进行了全基因组测序,以检查其靶标之外的任何突变。

为了获得基线突变率,将Cas9处理的小鼠品系的基因组与25只未处理的对照小鼠的基因组进行了比较。在31个Cas9小鼠品系中,未发现脱靶突变,但在其余20个品系中平均鉴定出2.3个此类突变。

但是,在用Cas9处理和未处理的小鼠细胞系中,研究小组发现每只动物平均有3500个自然发生的突变。

令人惊讶的是,这些结果表明,自然发生的突变数量远远超过了Cas9引入的突变数量。他们还表明,正确设计指导RNA时,脱靶诱变非常罕见。

研究结果为近交实验小鼠的使用增添了背景

这些发现加强了对近交实验室小鼠在遗传学研究中用途的理解,并为研究人员在进行实验时所做的假设增添了背景。

从历史上看,我们使用自交系小鼠来研究小鼠的遗传学,因为它们的基因组仅在某些特定的位置存在差异,并且我们已经假定小鼠之间的任何差异都是由于这些差异引起的。但是,我们发现,即使在同一窝的小鼠中,也可能存在成千上万的自然遗传差异。”

纳特说,研究结果强调了需要意识到在基因组中使用Cas9和其他工具的认识可能没有以前想象的那么好。

接下来,研究人员计划研究抑制或增强DNA修复的酶是否会影响新突变发生的速率。他们还打算评估在增强Cas9诱变效率和提高其准确性之间的权衡。

Nutter及其小组希望他们的发现将有助于导致更好的指导RNA的发展,以及对对照组的改进使用和对实验设计的更全面的了解。

研究小组指出,这种改进的知识在具有潜在治疗应用的基因编辑研究中尤其重要,包括对基于基因疗法的安全性和有效性的研究。

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