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高效液相色谱蛋白纯化

在这次采访中,AZoNetwork向Knauer讲述了FPLC在蛋白质纯化中的应用,以及它的产品如何使科学家获得最多的液相色谱;由Matthew Rafferty驾驶。

FPLC是一种快速蛋白液相色谱法,是一种用于从生物分子中提炼蛋白质的技术。所建立的一般系统类似于制备小分子的HPLC,通常由洗脱液泵、样品喷射器、便于实际纯化的柱和检测器组成。在传统的高效液相色谱中,紫外/VIS是检测信号最常用的技术。在FPLC中,紫外检测器与导电性和pH检测器相结合,不仅可以监测洗脱的样品,还可以监测所使用的阻尼器。FPLC的目标通常是将分离的生物分子收集成馏分。这可以手动驱动,但主要由分数收集器自动化。

图1:简化FPLC的建立

主要的区别可以在名称中找到。高压液相色谱(HPLC)是在UHPLC系统中1200 bar的高压下进行的,而FPLC主要是在30 bar以下的低压下进行的。这是由于生物分子和柱状基质的脆弱性,它们只在低压下稳定。

另一个主要区别是FPLC中使用的溶剂。为了蛋白质的纯化,人们使用盐阻尼器来防止生物分子的变性。传统高效液相色谱中使用的有机溶剂会破坏蛋白质的原生结构。在使用盐阻尼器时,不使用不锈钢是至关重要的,因为不锈钢主要用于HPLC系统,因为腐蚀可能发生。另一个大的不同是FPLC执行通常在4°C阻止变性的目标分子。在设计FPLC系统时,必须考虑所有这些参数。

图2:FPLC中使用的主要方法。

净化方法由系统中使用的柱定义。在FPLC中,四种主要方法是尺寸排除色谱(SEC)、亲和力色谱(AC)、离子交换色谱(IEX)和疏水相互作用色谱(HIC)。

大小排除色谱是根据生物分子的大小分离生物分子。第二柱的介质由多孔颗粒组成。较小的分子可以在这些孔隙中扩散,并被媒体保留更长的时间,而较大的生物分子几乎不相互作用,因此不会首先洗脱。

利用一种特定的蛋白质亲和力柱介质进行纯化,称为亲和力色谱法。目标分子在柱中部的特定卡住执行一个由三个阶段组成的协议:加载、清洗和洗脱。在此过程中,具有柱介质特定强制性质的分子与所有剩余污染物分离。

另一方面,在离子交换色谱中,生物分子是根据其在特定pH下的电荷分离的,在疏水色谱中,生物分子是根据其疏水性相互作用分离的。

可耐尔FPLC投资组合的基本原则是活力、灵活性、可升级性和德国制造的最小足迹。AZURA FPLC是生物相容性的(自由金属),可以在寒冷的房间中操作。多种功能,如通过自动陈列自动注入样品,柱开关,减震器和样品的选择,以及分数的收集,使用户能够自动化净化过程。大量不同的探测器使目标分子可见。所有供应商的列的不同流量和兼容性提供了最大的灵活性。

客户不必担心在购买特定系统时陷入僵局。相反,他们可以根据自己的需要更换或升级系统,使用简单而独特的部件,如额外的泵或开关阀。

特别是在色谱系统中,阀门是一个被低估的部件。然而,如果你仔细想想,一个正确位置的阀门可以产生巨大的效果,例如帮助您的净化过程自动化,或者允许可选的反流净化步骤更有效地清洗柱。

图3:灵活的系统尺寸

2018年10月,我们将预包装的FPLC柱添加到我们的投资组合中,非常适合我们的AZURA生物净化系统。我们为琼脂糖和右旋糖的亲和力、离子交换和平均大小排除色谱提供了Sepapure柱和大多数材料。预包装的FPLC柱可作为1 ml和5 ml墨盒使用,兼容标准10 - 32窥视UFN连接。所有ca柱均由100个μm琼脂糖颗粒固定的粘合剂组成,抗体结合能力< 15 mg/ml (ProteinG),抗体结合能力< 30 mg/ml(蛋白A),标记蛋白结合能力< 40 mg/ml(其标签),标记蛋白结合能力< 10 mg/ml (GST标签)。IEX柱也是基于100个μm琼脂糖颗粒,电荷结合剂和离子容量< 0.12 mmol/ml。

简而言之,我们很自豪能够为客户提供完整的软件包:从应用程序到硬件和软件的完美解决方案。

通过自由组合设备和阀门,客户可以根据应用程序完全定制他们的系统,而不必妥协。KNAUER总是很高兴为特定的净化任务设置完美的解决方案。此外,AZURA的生物净化系统可以很容易地扩展,这样系统就可以随着遇到的任务而生长。

我们提供一种高度通用的FPLC软件PurityChrom,它非常适合生物尿液分析领域的应用,因为它是一种基于体积的色谱软件。该软件单独提供了一个功能可调的系统可视化,即使在复杂的设置下也可以直观地手动操作FPLC。由于FPLC和PurityChrom的安装非常灵活,我们的客户可以为复杂的方法编写方法,并让用户完全控制净化。

您可以在我们的Web页面https://www.knauer.net/en/Systems-Solutions/FPLC上找到大量信息,以及我们的FPLC手册和我们在实验室中使用KNAUER FPLC系统运行的许多应用程序。

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