罗格列酮联合雷帕霉素抑制多囊肾囊肿衬里上皮细胞的增殖及机制研究

【摘要】：常染体显性多囊肾病(ADPKD)是人类最常见的单基因遗传性肾病,

发病率在1/400-1／1000,我国约有150万患者,占终末期肾衰竭病因5%-10%。

ADPKD主要特征表现为双侧肾脏出现许多个进行性增大的液性囊泡,最终破坏

肾脏的结构和功能。50%患者在60岁时会进展至终末期肾衰竭。ADPKD除累及

肾脏外,还引起肝、胰囊肿、心瓣膜病、结肠憩室和颅内动脉瘤等肾外病变,是一

种严重危害人类健康的系统性疾病。多年来,肾脏病学者一直致力于寻找治疗多

囊肾病的有效方法,基因治疗目前存在许多障碍有待克服,通过药物治疗延缓肾衰

竭进展是目前的主要研究方向。多囊肾病治疗需要早期、长期用药,因此药物的

安全性成为研究者关注的焦点。由于ADPKD的分子发病及调控机制非常复杂,

很多问题尚未阐明,因此针对不同发病环节研发不同药物,联合用于治疗不仅可增

强疗效,而且减少不良反应,将具有潜在的的应用前景。噻唑烷二酮类PPARy激

动剂,如吡格列酮和罗格列酮等,主要用于糖尿病治疗。近年来研究发现,噻唑烷二

酮类PPARy激动剂可抑制多种肿瘤细胞的增殖。2001年Muto等首先观察到吡

格列酮可延长多囊蛋白1基因敲除小鼠(pkdl-/-)的生存期(通常在胎儿期死亡)；我

科先前动物实验发现,罗格列酮可抑制Han:SPRD大鼠囊肿的进展,延长大鼠生存

期,但其机制尚未完全阐明。mTOR信号通路异常激活被认为是多囊肾病发生的

重要机制,新生血管的形成也可促进多囊肾病的进展；因此我们探讨罗格列酮对

mTOR信号通路的作用,研究其对新生血管形成中起重要作用的血管内皮生长因

子(VEGF)的作用；同时观察罗格列酮与mTOR抑制剂雷帕霉素联合应用对延缓

ADPKD进展的作用,为治疗多囊肾病寻找新的途径。为此,我们首先研究了罗格

列酮对多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的作用。多囊肾囊肿

衬里上皮细胞系(WT9-12)由美国哈佛大学周晶教授馈赠。培养的WT9-12细胞给

予不同浓度的罗格列酮培养24、48、72h,采用MTT法检测结果显示：罗格列酮

明显抑制WT9-12细胞的增殖,呈时间、剂量依赖性。预72h时,50%抑制率浓度

为100μM。采用流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,结果显示罗格列酮明显抑制

WT9-12细胞周期,使细胞停滞于G0／G1期,G0／G1期细胞增加30%,与对照组

比较有差异有显著性意义(P0.05),其对细胞凋亡的影响不大,罗格列酮浓度高达

200μM时,仅使细胞凋亡增加6%。多囊肾病的发展过程伴有胰岛素生长因子

1(IGF-1)表达的增加,我们的研究发现囊肿衬里上皮细胞对IGF-1的刺激反应较其

它永生化肾小管上皮细胞(RCTEC)更为明显。IGF-150ng/ml可诱导囊肿衬里上皮

细胞增殖增加20%,而对RCTEC无明显影响。罗格列酮可完全抑制IGF-1诱导的

WT9-12细胞增殖,该作用在罗格列酮12.5μM时即表现明显的抑制作用。说明罗

格列酮在有IGF-1作用下对囊肿衬里上皮细胞的增殖抑制作用更为明显。mTOR

信号通路异常激活在多囊肾病发病及发展中起重要作用,为多种发病机制的共同

环节,抑制mTOR信号通路可明显抑制多囊肾病的进展,p70S6K及4E-Bp1是

mTOR两个主要下游底物。用不同浓度的罗格列酮作用WT9-12细胞24h,收集细

胞,提取总蛋白,采用Westernblot方法检测p-mTOR/mTOR及其下游

p-p70S6K/p70S6K、p-4E-Bp1/4E-Bp1。结果显示罗格列酮下调p70S6K磷酸化水

平,呈时间及剂量依赖性,而对mTOR及其另一个下游底物4E-Bp1的磷酸化水平

无明显影响。mTOR特异性抑制剂雷帕霉素联合罗格列酮抑制p70S6K的磷酸化

作用强于单用罗格列酮,不仅表明罗格列酮是不经由mTOR抑制p70S6K的磷酸

化,且雷帕霉素联合罗格列酮可对mTOR信号通路下游p70S6K的磷酸化抑制有

叠加作用,也为mTOR抑制剂雷帕霉素联合罗格列酮治疗ADPKD提供理论基础。

罗格列酮的作用有PPARy依赖和非依赖两种途径。为研究罗格列酮对多囊肾囊

肿衬里上皮细胞mTOR/p70S6K信号通路的影响是否通过PPARy依赖途径,在给

予PPARy特异性抑制剂GW9662预孵后再给予罗格列酮发现：GW9662仅部分

抵消了罗格列酮对细胞增殖的抑制作用。同样,在给予GW9662抑制剂后再给予

罗格列酮可抑制罗格列酮对p-p70S6K的下调效应,进一步采用siRNA干扰技术,

将PPARysiRNA瞬时转染WT9-12细胞后,采用Westernblot检测发现,罗格列酮

仍部分抑制p70S6K的磷酸化,这些结果表明罗格列酮对细胞增殖抑制以及对

mTOR/p70S6K信号通路的抑制作用可能部分通过PPARy依赖性和非依赖性两

条途径实现的。新生血管的形成是肿瘤进展及转移的重要机制,也是多囊肾病进

展的主要因素。VEGF在新生血管形成中起着重要作用。低(缺)氧可诱导低氧诱

导因子-1α(HIF1-α)高表达,继而促进VEGF表达。我们对多囊肾病模型Han:SPRD

大鼠的观察发现,在4周龄大鼠肾脏,VEGF表达已增加,此时局部缺氧不明

显,HIF1-α的表达明显上调。但是,TNF-α表达在早期大鼠肾脏出现增加,表明

VEGF的表达上调早于HIF1-α,且与局部的炎症同步。细胞实验进一步证实,TNF-a

不仅能诱导多囊肾囊肿衬里上皮细胞表达VEGF,其他炎症因子如LPS也同样可

诱导VEGF的表达；说明诱导VEGF的表达并不是TNF-α所特有,是炎症的共有

特征。细胞实验还证实TNF-a并不能诱导HIF1-α的表达,也提示TNF-α对VEGF

的作用并不通过HIF1-α。因此,早期抑制炎症反应也可减缓多囊肾病的进展。罗

格列酮可下调囊肿衬里上皮细胞VEGF的表达,呈剂量依赖性,而且罗格列酮对

TNFα诱导的VEGF高表达抑制更明显,可使其下降到应用TNFa前的水平。罗格

列酮长期用于糖尿病的治疗,副作用小,因此适用于多囊肾病的早期治疗及长期治

疗。基于以上结果,我们联合应用罗格列酮和雷帕霉素抑制多囊肾病囊肿衬里上

皮细胞的增殖及VEGF的表达,从而为多囊肾病的治疗提供新的方法。我们给予

WT9-12细胞不同浓度的罗格列酮、雷帕霉素、罗格列酮+雷帕霉素,作用72h,采

用MTT法检测细胞增殖,计算联合用药指数(R值)、流式细胞技术检测细胞周期

及凋亡,采用realtime-PCR技术检测VEGFmRNA的表达。结果显示：罗格列酮

和雷帕霉素均能抑制囊肿衬里上皮细胞增殖,抑制细胞周期的进程,并且二者联合

应用有叠加作用,罗格列酮单独应用对细胞凋亡的作用不明显,但与雷帕霉素联合

应用可明显促进凋亡,具有协同效应。二者具有协同效应的机制可能与罗格列酮

抑制mTOR下游p70S6K的磷酸化,雷帕霉素抑制mTOR活性,双重阻滞促进了细

胞凋亡。我们采取序贯用药的方式研究发现：先用雷帕霉素再序贯应用罗格列酮

可增强抑制细胞增殖的作用,具有明显的协同效应(R1)。雷帕霉素和罗格列酮可分

别抑制多囊肾囊肿衬里上皮细胞VEGF的表达(VEGF表达下调30%和18%),但两

药联合作用细胞时,二者的作用可明显加强(VEGF下降54%)。一方面可能与罗格

列酮及雷帕霉素对mTOR信号通路的共同作用有关,另一方面,罗格列酮可抑制炎

症,抑制TNFα的表达,而我们的研究发现VEGF的表达与TNFα有关,因此罗格列

酮也可能通过下调TNFα抑制了VEGF的表达,从而通过多途径,不同的信号通路

共同作用,抑制多囊肾病的进展。总之,本研究表明噻唑烷二酮类PPARy激动剂

罗格列酮可通过直接抑制mTOR的下游p70S6K的磷酸化而抑制囊肿衬里上皮细

胞的增殖、抑制细胞周期进程及促进细胞凋亡,此作用为PPARy依赖性的。多囊

肾囊肿衬里上皮细胞较RCTEC对IGF-1刺激更为敏感,而罗格列酮可完全阻断

IGF-1所诱导的囊肿衬里上皮细胞的增殖。罗格列酮可下调囊肿衬里上皮细胞

VEGF的表达,从而抑制多囊肾病的血管形成,此作用在有TNFα刺激下更明显,可

完全抑制TNFα诱导的VEGF上调。罗格列酮与雷帕霉素联合应用可明显抑制细

胞增殖和细胞周期、促进细胞凋亡及VEGF表达,二者联合应用较单药有明显的

叠加效应,而序贯用药方式,即先用罗格列酮再序贯应用雷帕霉素,对细胞的增殖

有明显的协同效应。目前多囊肾病的治疗仍是个难题,我们致力于研究联合用药

及不同联合用药方式对多囊肾病的作用,期望通过多种药物的联合应用,减少药物

的副作用,增强疗效,将在多囊肾病的治疗中有更好的应用前景。本实验的不足之

处在于缺乏动物实验结果的支持,但这项工作已经在进行中。

【关键词】：常染体显性多囊肾病过氧化物酶体增生物激活受体罗格列酮

雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素

【学位授予单位】：第二军医大学