尽管对CRISPR-Cas9基因编辑抱有很高的期望和高投入，但科学家仍然需要了解它如何在人体中发挥作用。在最新的例子中，加利福尼亚大学伯克利分校的科学家们发现，人们对Cas9酶切DNA后细胞如何修复基因组的假设是错误的。

这一发现深入探讨了为什么CRISPR-Cas9基因编辑在几乎所有细胞中都能很好地发挥作用，尽管在所有细胞中都没有取得同样的成功。并且它可以帮助研究人员提高细胞将新DNA插入基因组的效率 - 例如用正确的DNA序列替换有害突变 - 并且通常调整CRISPR-Cas9编辑以获得期望的结果。

“如果你想治疗镰状细胞性贫血，那么你成功的机会与用正确的镰状细胞基因取代突变的镰状细胞基因的效率密不可分，”加州大学伯克利分校博士后研究员Chris Richardson说道，他是一篇论文的第一作者。调查结果。“如果你从患者身上收获了一百万个细胞，并且你的插入率为10%，那就不如你有30%到40%那么好。能够操纵这些细胞以增加这个过程的频率，称为同源导向修理，令人兴奋。“

“基因编辑非常强大，有很多希望，但到目前为止，有很多试验和错误。它在人体细胞中的工作方式一直是一个有很多假设的黑盒子，”主要作者Jacob Corn说。 ，加州大学伯克利分校和分子与细胞生物学的兼职教授。“我们终于开始了解正在发生的事情。”

Corn，Richardson和他们的同事将在8月出版的Nature Genetics期刊上发表他们的研究结果，现在可以在网上找到。

直到最近，Corn还是创新基因组学研究所的生物医学科学主任，该研究所是加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校之间的联合CRISPR研究项目。今年秋天，他将加入瑞士苏黎世的ETH学院。

CRISPR依赖于DNA修复

CRISPR-Cas9具有革命性，因为它可以精确地利用基因组中数十亿的特定DNA序列进行切割，并切割双链DNA分子。但在那之后，由细胞来修复损伤。

修复可以通过两种方式进行。酶可以将悬垂末端缝合在一起，这通常导致一个或多个碱基 - DNA的构建块被添加或删除，破坏基因的功能。或者，其他酶可以用与DNA切割上游和下游的DNA序列匹配的单链DNA修补断裂。创建互补DNA链以完成双链修复。

前者称为非同源末端连接，似乎是CRISPR切割后最常见的结果。后者，同源定向修复，在某些类型的细胞中比其他细胞更频繁地发生，并且需要存在可用于修补破裂的DNA片段。研究人员经常提供单链DNA，并希望细胞使用它来用新的序列替换错误的序列。

然而，这两个过程都有点神秘，没有人知道为什么有些细胞很容易在DNA中修补，而其他细胞很少这样做。

“将CRISPR-Cas9用于医学或合成生物学应用的热情非常高，但没有人真正知道将它放入细胞后会发生什么，”理查森说。“它会创造这些中断并依靠细胞来修复它们。但人们并不真正理解这个过程是如何运作的。”

为了找出哪些DNA修复酶对CRISPR切割后的同源定向修复至关重要，Richardson和Corn采用了一种称为CRISPR干扰(CRISPRi)的技术，一次一个地敲除已知或怀疑参与的2,000多个基因。 DNA修复，对健康细胞至关重要的功能。

令人惊讶的是，许多被证明是重要同源导向修复的基因在沉默后显着下降 - 参与了一个不被认为参与CRISPR修复的重要修复系统。

范可尼贫血症

该途径涉及21种不同的蛋白质，被称为Fanconi贫血途径，因为如果这些蛋白质的任何基因受损，人们会发展出Fanconi贫血症，这是一种罕见但严重的遗传性疾病，其中骨髓不能产生足够的新血细胞。它与出生缺陷和高风险癌症有关，包括在童年时发生白血病的几率为10%。很少有患者活到30岁以上。

该途径已知并研究了数十年，但人们普遍认为它可以修复一种特定类型的DNA损伤：DNA链间交联，其中一条DNA链上的核苷酸与相邻链上的核苷酸紧密结合，干扰DNA复制并经常杀死细胞。研究人员在20世纪80年代报道了同源定向修复与Fanconi贫血途径之间的联系，但它被忽视或误解，Corn指出。

“基于我们的工作，我们认为Fanconi贫血途径在修复其他类型的病变方面起着重要作用，但最好将其理解为修复双链断裂的途径，”Richardson说。“Cas9编辑后，如果你想插入新DNA，就需要Fanconi贫血途径。”

然而，Fanconi贫血途径在修复CRISPR断裂中的重要性使人怀疑一些计划的CRISPR治疗方法本身。没有活跃的Fanconi贫血途径，在Cas9切割后，细胞可能无法用正常基因替换其突变基因。

事实上，Fanconi贫血途径的活性水平可能会影响CRISPR在特定细胞中插入DNA的效率。研究人员得出结论，虽然末端连接是双链断裂后的默认修复机制，但Fanconi贫血途径与其竞争，并且更高的活性导致更多的同源定向修复和更少的末端连接。

癌症治疗

虽然这些发现有助于科学家更好地理解人体细胞中的DNA修复机制，但它们也可以帮助研究人员开发针对癌细胞中DNA修复的抗癌疗法。由于其他因素现在似乎与修复双​​链断裂有关，因此本研究扩大了可能被错误调节的蛋白质列表，以便加剧癌细胞中的DNA修复并使其更容易死亡。

Richardson还发现该途径中的21种蛋白质之一FANCD2始终位于CRISPR-Cas9产生的双链断裂位点，表明它在调节新DNA插入基因组中起重要作用。削减网站。可以调整FANCD2以提高细胞通过同源定向修复插入DNA的频率。

“此外，由于FANCD2本地化为Cas9中断站点，因此您可以使用FANCD2映射Cas9在任何细胞类型中切割的位置，”Richardson说。“如果您编辑一组细胞，并且想要了解目标和非目标切割的位置，您只需绘制基因组中FANCD2的位置，即可找到切割位置。”

“整个Fanconi贫血途径影响终端连接和同源定向修复之间的平衡;它就像一个交通警察，”Corn说。“因此，患者的基因型将影响您进行基因编辑的方式。”