杜克大学的研究人员已经证明，使用CRISPR基因组编辑技术的单一系统治疗可以安全，稳定地纠正遗传性疾病 - 杜氏肌营养不良症(DMD) - 在小鼠中使用超过一年，尽管观察到免疫反应和替代基因编辑结果。该研究于2月18日在线发表在“ 自然医学 ” 杂志上。

2016年，Duke的Rooney家族生物医学工程副教授Charles Gersbach发表了一项成功使用CRISPR治疗遗传性疾病动物模型的方法，其策略有可能转化为人类治疗。此后发表了许多其他的例子，针对人类疾病的几种基因组编辑疗法目前正处于临床试验阶段，还有更多的例子。

Gersbach的最新研究重点是DMD的小鼠模型，这是由身体无法产生肌营养不良蛋白引起的，肌营养不良蛋白链是一种将肌纤维内部与周围支撑结构结合的长蛋白链。

抗肌萎缩蛋白由含有79个蛋白质编码区的基因编码，称为外显子。如果一个或多个外显子被遗传突变破坏或删除，则链不会被构建，导致肌肉慢慢撕裂并恶化。大多数患者在10岁时就坐轮椅，并且不能超过20岁或30岁出头。

自2009年以来，Gersbach一直致力于Duchenne的潜在遗传治疗。他的实验室是最早开始关注CRISPR / Cas9的实验室之一，这是一种细菌防御系统的修改版本，可以对入侵病毒的DNA进行定位和切片。他的方法使用CRISPR / Cas9来剪切基因突变周围的肌营养不良蛋白外显子，让身体的天然DNA修复系统将剩余的基因重新缝合在一起，以创建一个缩短但功能性的肌营养不良蛋白基因。

“随着我们继续努力开发基于CRISPR的基因疗法，测试我们的假设并严格评估这种方法的所有方面至关重要，”Gersbach说。“我们实验的一个目标是测试该领域正在讨论的一些想法，这将有助于我们了解CRISPR一般治疗遗传性疾病和特别是Duchenne肌营养不良的潜力。这包括监测反应的长期耐久性面对针对细菌Cas9蛋白的潜在免疫反应。“

第一个为期八周的研究表明功能性肌营养不良蛋白恢复，肌肉力量增加。然而，它没有探索治疗的长期耐久性。

“人们普遍认为，基因编辑会导致永久性基因修正，”Gersbach说。“但是，探索可能破坏基因编辑效果的理论可能性非常重要，例如失去处理过的细胞或免疫反应。”

这项新研究的目的是探索可能改变基于CRISPR / Cas9的基因编辑的长期影响的因素。

领导这项工作的Gersbach实验室的博士后研究员克里斯托弗·尼尔森(Christopher Nelson)对携带缺陷型肌营养不良蛋白基因的成年和新生小鼠静脉内施用单剂量的CRISPR疗法。在接下来的一年中，研究人员测量了成功编辑了多少肌肉细胞以及进行了哪些类型的遗传改变，以及针对细菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫应答的产生，Cas9充当“剪刀”这削弱了基因组。

其他研究报道，小鼠免疫系统可以对Cas9产生反应，这可能会干扰CRISPR疗法的益处。一些研究小组还报告说，有些人对Cas9蛋白具有预先存在的免疫力，这可能是因为之前接触过细菌宿主。

“好消息是，尽管我们观察到抗体和T细胞对Cas9的反应，但似乎都没有在这些小鼠中产生任何毒性，”尼尔森说。“这种反应也没有阻止该疗法成功编辑肌营养不良蛋白基因并产生长期蛋白质表达的能力。”

结果还提出了解决潜在挑战的方法，如果它们在未来出现的话。例如，研究人员观察到，当没有完全发育免疫系统的2日龄小鼠进行静脉内治疗时，没有检测到免疫反应。CRISPR基因组编辑保持稳定，在某些情况下甚至在一年内得到加强。人们可以想象将治疗作为一种规避或调节不需要的免疫反应的方法给婴儿。

然而，Gersbach和Nelson承认，小鼠免疫系统的功能通常与人体免疫系统完全不同。新生儿DMD筛查目前尚未广泛开展; 大多数Duchenne诊断发生在儿童三至五岁时。为了应对这一挑战，Gersbach说在治疗期间抑制免疫系统可能是一种可行的方法。

研究人员还在研究限制Cas9仅在短时间内表达或递送至肌肉细胞的潜在策略，这可能会减少免疫检测。

“我们很高兴地观察到所有小鼠在治疗后一年都表现良好，但我们的研究结果表明，随着我们向更大的动物模型迈进，需要更加关注免疫反应，”尼尔森说。

Nelson和Gersbach此前曾调查过CRISPR / Cas9的脱靶编辑潜力，无意中修改了基因组中的其他位点，并报告了可能脱靶位点的最小活性。然而，最近的其他研究报道，CRISPR有时可以在正确的位点进行基因编辑，但不能以预期的方式进行。例如，一些研究表明，CRISPR可以切除比预期大得多的遗传切片，或者DNA片段可以嵌入切割位点。之前在基因组编辑研究中未报告这些类型的编辑，因为所使用的方法仅检测到预期的编辑。

为了全面地绘制肌营养不良蛋白基因中发生的所有编辑，Nelson使用了DNA测序方法，该方法无论何时都会报告任何类型的编辑。令人惊讶的是，除了目标外显子的预期去除之外，还进行了许多类型的编辑，包括从编码CRISPR / Cas9系统的病毒载体中高水平插入DNA序列。

根据组织的类型和CRISPR递送的剂量，多达一半的目标编辑导致这些替代序列变化。尽管该结果令人惊讶，但是非预期的序列变化似乎不会影响该CRISPR / Cas9基因编辑方法对DMD的安全性或功效。

“在这种情况下，这些编辑都不一定引起关注，因为肌营养不良蛋白基因已经存在缺陷，”尼尔森说。“话虽这么说，任何意想不到的结果都可能会剥夺你试图实现的基因编辑的效率，这支持了设计在未来研究中客观地识别和减轻替代编辑的方法的重要性。”

“以前的研究表明，其中一些类型的编辑可能会发生，”格斯巴赫说。“但这是使用治疗相关方法对动物模型中这些事件进行的首次综合测量之一。展望未来，需要仔细监测这一现象并更好地理解。避免这些替代编辑并增加预期频率的方法编辑对于最大限度地发挥基因组编辑治疗疾病的潜力非常重要。“