兰特生物学家罗杰·英尼斯和他的团队在美国印第安纳大学布卢明顿希望了解植物细胞是怎么死的。在2012年秋天，他们用细菌病原体感染了模式生物拟南芥的叶子。然后他们切下感染叶片的薄片，并将切片放在电子显微镜下。当他们在细胞壁和内部质膜之间的空间中反复看到一束圆形结构时，研究人员感到惊讶。Innes不熟悉微小的斑点，向同事们展示了图像，他们指出了他的老研究，有些可以追溯到20世纪60年代，这些研究在其他植物中描述了类似的东西：一组称为囊泡的小的膜包裹的球体，被称为更大的膜多泡体(MVB)。

在植物细胞内发现水泡并不是那么罕见; 植物和动物细胞使用囊泡进行各种各样的事情，例如在细胞周围运送分子或从细胞膜中回收蛋白质。但是Innes和其他人已经将这些MVB捕获到与质膜融合并释放他们的货物 - 那些较小的膜结合囊泡 - 进入细胞膜与其壁之间的空间。这张照片与哺乳动物细胞和真菌细胞排出一种称为外泌体的特定类型囊泡的方式非常相似，该外泌体从MVB内部开始，其他外泌体在MVB与质膜融合时自由释放。

外来体在1983年首次在未成熟的大鼠血细胞中被描述，并且他们的发现随后迅速引起了研究兴趣的爆发。在哺乳动物中，外泌体在细胞 - 细胞通讯，免疫反应和恶性肿瘤等中起重要作用。它们的内容也可以反映其起源细胞的状态，近年来，这些细胞使得囊泡成为研究创伤性脑损伤和癌症等疾病的生物标志物的焦点。尽管外泌体在哺乳动物中的重要性越来越受到重视，但除了旧的显微镜图像之外，对植物中的外泌体一无所知，这表明它们的存在。“在这些报纸上几乎没有对它们发表评论，”英纳斯回忆道。

他看到了健康和垂死细胞中的结构，所以他们似乎没有在细胞死亡中起作用，这是他最初开始研究的现象。但是Innes对他怀疑是外泌体的东西很感兴趣，并且他要求研究生Brian Rutter找到一种方法从拟南芥叶片的细胞外空间中纯化结构。可以从细胞培养液，血液，尿液和任何数量的其他体液中收集来自人或动物细胞的外来体。植物中类似的液体并不那么容易收集 - 这可能是其中一个原因，Innes说，因为缺乏对植物外泌体的研究。“无法净化他们，你无法真正说出他们的角色是什么，”他说。

截至2014年底，Rutter和Innes已经开发出一种工作方案，使他们能够首次描述纯化植物外泌体的含量。2从那时起，英尼斯的组和其他拥有先进的这些囊泡突飞猛进的理解。例如，囊泡可以解释植物如何发出防御性蛋白质和RNA来保护自己免受病原体侵害，它们可能会成为未发现蛋白质的宝库，加州大学河滨分校的植物科学家Hailing Jin说。。“以前[植物生物学家]无法回答有很多未解决的问题，”她说，“现在他们觉得外泌体可以提供非常好的解释。”

包括Innes和Jin在内的研究人员刚刚开始研究植物外泌体的表面。一些科学家也开始将其潜力视为农业乃至医学的有用工具。

证实了外泌体释放理论

当Innes和他的团队开始研究外泌体时，囊泡存在的证据已经建立多年。除了具有50年历史的电子显微照片之外，最早的线索之一来自2003年描述拟南芥的报告。植物抵抗一种白粉病侵袭所需的基因。由于被称为haustoria的真菌饲养结构进入细胞壁并压靠质膜，植物细胞沉积材料以加强裂口附近的细胞壁并防止真菌破坏质膜。对这种防御措施至关重要的两种蛋白质，称为PEN1和ROR2，被证明是一种名为SNARE的哺乳动物蛋白质的同源物。SNARE在哺乳动物和酵母细胞膜中发现，在膜融合和外泌体释放中发挥作用。3

目前尚不清楚外泌体形成和释放PEN1和ROR2的哪些步骤起作用，但它们与SNARE的同源性是膜融合以某种方式参与保护植物免受真菌渗透的第一个暗示，Mads Nielsen说，他是植物和土壤科学家。哥本哈根大学。当两个不同膜上的SNARE蛋白质相互锁定时，它们将相对的膜带到一起并使它们融合。当这种融合发生在细胞内囊泡和细胞的质膜之间时，囊泡的内容物从细胞中释放出来，这与MVB用于释放外泌体的过程相同。

植物释放外泌体的一个更诱人的暗示出现在2009年，当时研究人员对拟南芥植物进行了基因工程改造，使得PEN1在某些波长的光线下发出绿光。在细胞外，绿色荧光蛋白(GFP)标签通常由于pH的变化而停止发光。但是一些研究小组注意到PEN1甚至在空间中仍然发出荧光，称为质外体，在植物细胞质膜外，表明蛋白质在某种程度上受到保护。4 “我们都种在同一时间，只有这样，我们可以看到这种现象出现的将是由外来体的分泌推测，”尼尔森说。

当Innes和Rutter正在寻找一种方法来验证其分离外泌体的技术时，PEN1是一个完美的标记。他们最初观察到的蛋白质和囊泡都在真菌吸器周围大量出现，植物倾倒细胞壁材料和蛋白质以保护自身。“我们认为这种蛋白质是否在那里积聚，这些囊泡在那里积聚，然后蛋白质可能在囊泡中，”Innes说。

Rutter设计了一种通过离心从拟南芥叶中提取质外体液的方法，然后根据其密度分离组分。在质外体含量中，他发现含有PEN1的囊泡直径在50到200nm之间，类似于哺乳动物外泌体，其范围从30到150.囊泡还含有通常在MVB中发现的蛋白质，已知它们在动物中宿主外来体。 。他说，这一调查线已经引领他的实验室走向了许多新的方向，因为该小组焦急地试图找出这些推定的外泌体内部究竟是什么以及它们对植物细胞的作用。

在植物感染的前线

在哺乳动物细胞中，外泌体以在相邻细胞之间携带信号而闻名，但它们还具有许多其他功能，例如将抗菌分子传递给入侵的细菌。当考虑外泌体在植物中的潜在作用时，Innes清楚地看到一些免疫功能是最好的起点。毕竟，他首先注意到外胚胎在持续感染期间被释放，而其他关于MVB的研究表明，这些结构在受感染的植物中更为普遍。5,6

为了测试外泌体在植物防御中的作用，Rutter感染了他的一半拟南芥植物细菌病原体。然后，他从感染和未感染的植物中分离出外泌体 - 总共约2,000种植物 - 并通过质谱分析其内容物。受感染的植物确实在其质外体中含有更多的外泌体，但Innes说这可能是因为感染会破坏细胞壁，使细胞内容物逃逸，而不是由于外泌体产生增加。并且质谱结果同样是模棱两可的，来自感染和未感染植物的外来体显示与全细胞的蛋白质含量相比，参与植物应激反应和免疫的蛋白质的富集。这首先让Innes感到惊讶，但他说这可能表明植物在感染开始时不会迅速形成新的囊泡，而只是使用现有的任何物质。“我现在更多地将它们视为预制武器库，

Innes和Rutter的研究很快被布宜诺斯艾利斯马德普拉塔国立大学Laura de la Canal领导的一个小组跟踪，他们去年报告说，来自向日葵的细胞外囊泡中几种防御相关蛋白的水平高于在植物周围的质外体。7同一组在培养皿中培养向日葵外泌体与真菌细胞，发现外泌体以某种方式进入真菌细胞并抑制真菌生长。

Jin对外泌体可能带入真菌以限制病原体的生长有一些想法。她的大部分职业生涯都在研究植物如何使用RNA来控制病原体防御途径中涉及的基因的表达。例如，短片RNA可以结合信使RNA的互补链以防止它们参与蛋白质的组装，这一过程称为RNA干扰。这些短RNA可以在产生它们的细胞内或在植物的其他细胞内起作用。近年来，Jin的团队和其他人发现，植物甚至可以将其RNA转化为入侵的病原体以阻止这种攻击，这种现象称为宿主诱导的基因沉默。但多年来，尚不清楚这些RNA如何从植物细胞到真菌细胞，反之亦然。

参见“ 王国之间的RNA干扰 ”

Jin和她的团队在去年报告拟南芥植物使用外泌体向入侵的真菌细胞中提供短干扰RNA 时，将这种不确定性放在了床上。8研究人员使用类似于Innes的方案，通过仅在植物中发现的膜融合蛋白以及与四跨膜蛋白具有同源性的蛋白质鉴定外泌体，四跨膜蛋白是在哺乳动物外泌体上发现的一组蛋白质。研究人员还将真菌细胞与植物外泌体一起培养，以产生GFP标记的四跨膜蛋白，果然，真菌细胞在紫外线下发出绿光，表明它们必须摄入外泌体。当Jin的团队用Botrytis 感染拟南芥植物时真菌，研究人员在真菌细胞内发现了42种不同的植物来源的短RNA。然后他们从纯化的拟南芥外泌体中分离出RNA，并在其中发现了31个相同的短RNA，这表明超过70%的进入真菌细胞的植物RNA使用外泌体作为其渡轮。

“因此，这有点回答围绕宿主诱导基因沉默的整个概念的长期困惑，”Innes说。

植物缺乏哺乳动物的外泌体加载机制

虽然他们的重点迄今一直是外泌体在植物防御中的作用，但Jin和Innes都在追求其他未发现的囊泡功能。例如，Jin的团队不仅在叶子质外体中发现了植物外泌体，而且在韧皮部中发现了植物外泌体，韧皮部是在整个植物中运输糖和其他可溶性物质的组织。“这意味着他们正在远距离移动，”她说。

外泌体可能是植物细胞之间通信的主要途径。大约一半的已知细胞外植物蛋白缺乏蛋白质所需的肽序列，以便通过胞吐作用穿梭于细胞外。没有这种肽信号，目前还不清楚这些蛋白质是如何进入质外体的。Jin说几个研究小组已经联系了她，要求他们帮助纯化外泌体，以确定这些无信号蛋白质是否通过在外泌体内移动来补偿它们缺乏特殊肽序列。

同时，Innes说他想知道外泌体和其他细胞外囊泡是否有助于植物发育。在来自向日葵质外体的细胞外囊泡中，de la Canal的研究小组发现了几种参与细胞壁重组的酶，这对植物的生长和发育非常重要。7

但即使研究人员更多地了解外泌体可以做什么，尼尔森和他的许多同事也更关心他们如何做到这一点。尽管植物和动物细胞内的囊泡运输是相似的，但是存在一些关键差异，这使得植物生物学家感到有点难过。例如，在哺乳动物中，称为早期内体的囊泡充当囊泡在细胞周围进出的途径。早期内体中的特殊蛋白质复合物分类并将载体装载到囊泡中，包括MVB，并确定囊泡是否注定要将其货物运输到溶解体中以被破坏或将质膜从细胞中释放出来。Nielsen说，植物没有早期内涵体，它提出了一个问题，它们的外泌体是如何形成的，载有蛋白质和RNA，并被打包成MVBs，哪个被送到质膜?“我们仍在努力弄清楚究竟发生了什么，”他说。

尽管缺乏知识，研究人员已经开始考虑如何将植物外泌体用于农业目的。例如，Jin说，通过确定天然植物外泌体用于渗透其病原体的特征，科学家理论上可以制造人工外泌体，用人造抗真菌短RNA或其他抗菌剂加载它们，并用它们来保护作物。考虑到医学应用，一些研究小组正在研究所谓的外泌体样纳米粒子，这些纳米粒子被认为在摄取植物材料后将植物microRNA和蛋白质传递到人类和动物的肠道组织中。9,10迄今为止的研究暗示了这些囊泡的治疗益处，例如激活小鼠肠道细胞中的抗炎基因9或保护小鼠免受酒精诱导的肝损伤。11最近的一项研究表明，从生姜中分离的外来体样颗粒输送微RNA小鼠肠道细菌，改变细菌的蛋白质生产和保护小鼠免受结肠炎的症状。12

Innes说这些外来体样颗粒只是从整个均质化的植物组织中分离出来的，这意味着它们代表细胞内外的囊泡。因此，目前尚不清楚外泌体 - 离开细胞的唯一囊泡 - 是否真的携带可影响人类生物学的蛋白质或RNA。Innes的小组希望通过在拟南芥中纯化的外泌体培养实验室中的癌细胞，并寻找细胞基因表达的变化，从而为这个问题带来一些清晰度。

对于Innes来说，这些新项目是完全未知的领域。“老实说，六年前我从未想过细胞外囊泡，”他说。“这是我们打算做的事情的完全转移。”随着对植物外泌体的研究继续聚集蒸汽，Innes说他并不孤单。“我认为这为一系列不同的实验室开辟了新的研究方向。”