矿化由成骨细胞介导，成骨细胞通过基质囊泡(MV)分泌矿物质前体，作为脊椎动物的基本过程。囊泡富含钙和磷酸盐，含有有机物质，如酸性蛋白质。现在发表在Science Advances上的一项新研究，Tomoaki Iwayama及其同事在牙周病学，生物医学研究，口腔科学，生物材料和口腔解剖学发展部门使用扫描电子辅助介电显微镜(SE-ADM)和超分辨率显微镜(SRM)来评估矿化条件下的活体成骨细胞纳米级分辨率。他们发现含钙囊泡是含有矿化纳米囊泡或基质囊泡(MVs)的多囊体。根据观察结果，MV可以与溶酶体一起运输并通过胞吐作用分泌。Iwayama等。提供了溶酶体可以在矿化成骨细胞中运输无定形磷酸钙的证据。

在骨矿化的生理过程中，磷酸钙晶体的沉积在细胞外基质中发生，作为所有脊椎动物的基本过程。1967年，生物学家Clarke Anderson和Ermanno Bonucci使用电子显微镜(EM)分别在细胞外空间中可视化矿物相关颗粒。科学家后来将这些颗粒识别为矿化纳米囊泡或基质囊泡(MVs)。在过去50年的MV研究中，生物学家一直在努力了解MV形成和分泌的机制，这在很大程度上仍然未知。

用EM 澄清活细胞的矿化过程是具有挑战性的，因为EM的样品制备需要化学固定和酒精脱水两个步骤。这些步骤可诱导人工制品，甚至溶解或除去不稳定的矿物前体，留下称为“ 晶体鬼 ” 的有机支架。虽然科学家成功地使用固定和脱水组织的EM过程来观察骨中矿化胶原纤维的结构，研究矿物质前体，但他们必须采用低温EM工艺来避免脱水，并且使用小标本进行昂贵，极快的冷却。

为了克服目前工作中的这些局限性，Iwayama等人。使用了一种称为扫描电子辅助介电显微镜(SE-ADM)的新型微观系统。该方法先前已经在水性介质中对哺乳动物细胞实现了纳米级分辨率和高对比度成像而没有染色。科学家使用相同的技术(高分辨率SE-ADM)探索在完整成骨细胞中观察MV的可能性，以了解 MV贩运的生物发生。对于成骨细胞系，他们使用鼠(小鼠)成骨细胞系KUSA-A1，在体外和体内具有高成骨能力。在充分条件下细胞培养后，Iwayama等。用SE-ADM观察细胞以鉴定正常的细胞内结构。科学家们观察到MVs 在成骨培养基中细胞生长4到10天后与胶原原纤维排列，并且由于融合或颗粒生长，分泌的粒径增加，其大小与之前的报告一致，表明它们确实是MV。

在用SE-ADM进一步检查后，他们注意到溶酶体途径涉及以与外来体类似的过程转运和分泌腔内MV。有趣的是，外泌体和MV都被归类为具有相似大小的细胞外囊泡; 它们均由成骨细胞分泌，并在细胞间通讯中具有共同的功能。

在下一步，Iwayama等。检查这些颗粒是否是含有钙和/或磷酸盐的MV。为此，他们将细胞在成骨培养基中培养7天，并使用SE-ADM观察它们以记录非晶面结构，没有晶面。这表明MVs没有结晶，但仍然是无定形的，这也是先前研究中记录的。当科学家在SiN(硅氮化硅)薄膜上检测MV时，他们观察到对应于磷，钙，碳和氧元素的尖峰。他们使用拉曼光谱证实了这一发现，以证明MVs中存在磷酸钙。

科学家们还研究了由磷脂酶(碱性磷酸酶)基因编码的医学病症的低磷酸盐血症的影响，其中成骨细胞在体外不会发生矿化。为此，他们使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术编辑成骨细胞的基因组以产生Alp1敲除的成骨细胞克隆。当Iwayama等人。使用高分辨率SE-ADM检测敲除克隆，他们没有观察到MV，由于没有磷和钙峰，使用光谱分析进一步证实了MV。

在使用SE-ADM直接观察MV的产生和分泌后，科学家们进一步研究了溶酶体参与MV的细胞内运输以观察活体成骨细胞矿化。他们在含钙成骨培养基中培养细胞，并用LysoTracker染色，以检测感兴趣的细胞内组分。Iwayama等。找到与溶酶体相匹配的钙黄绿素囊泡，以表明与钙黄绿素+囊泡融合后溶酶体内MV的生物发生。科学家们在实验中进行了功能丧失和功能抑制研究，以进一步解构这些途径并检测体外活细胞矿化过程中的细胞内作用机制。

科学家此前曾报道过，由于成骨细胞线粒体中存在电子致密的富含钙和磷的颗粒，线粒体在矿化过程中受累。用改进的冷冻技术观察到这一点。此外，报告还表明溶酶体和线粒体的直接接触具有功能意义。当Iwayama等人。用LysoTracker和MitoTracker染色细胞并在N-SIM结构照明超分辨率显微镜(SRM)下观察细胞内组分。他们观察到线粒体旁边存在大多数符合钙黄绿素的囊泡，并与溶酶体相匹配。在SRM时间推移成像期间，科学家们进一步获得了LysoTracker的细胞内转运观点，其中含有与线粒体相邻的静态钙黄绿液泡融合的囊泡，以验证其假设。

通过这种方式，结合对其他SRM系统和其他细胞系的观察，Tomoaki Iwayama及其同事提出了一种矿化机制。其中溶酶体在细胞内MV生物发生和成骨细胞内的运输中起重要作用。将溶酶体用于成骨细胞以运输无定形磷酸钙而在其在胞质溶胶中转运期间没有结晶是合理的。该科学家旨在进行进一步的实验以了解MV的调节分子，并研究MV和外泌体是否具有与其产生，分泌和功能相似的相似构成和机制。本工作中使用的SE-ADM策略可以低成本安装到现有的扫描电子显微镜设备中。该研究开发的工作将提供适用于所有科学领域的纳米级非侵入性，高分辨率成像。